白 林，郭興道，任 韡（. 解放軍總醫(yī)院藥品保障中心藥檢室，北京 00853；. 河北北方學院，河北 張家口 075000）

感冒清熱顆粒是2010年版《中國藥典》收錄的品種，主要由荊芥穗、防風、柴胡、葛根等11味中藥材組成[1]。對于感冒清熱顆粒中葛根素的含量測定，中國藥典已有規(guī)定，但其中荊芥穗和薄荷中總胡薄荷酮的鑒別及含量測定均未收載，尚無質量控制標準。目前，已有文獻[2]報道了測定感冒清熱顆粒中荊芥穗、薄荷中總胡薄荷酮的方法。薄荷和荊芥穗是感冒清熱顆粒中具有抗病原微生物[3]，解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛作用[4]的成分，我們采用HPLC法同時測定感冒清熱顆粒中葛根的主要有效成分葛根素、薄荷與荊芥穗中總胡薄荷酮的含量，獲得滿意效果。

1 儀器與試藥

CX-300型超聲波清洗機（北京市天海雙龍醫(yī)療器械有限責任公司）；Agilent1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，含自動脫氣機、VWD檢測器、四元梯度泵和化學工作站）；UV-2550型紫外分光光度儀（日本島津）。

葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-200209）；胡薄荷酮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111706-201004）；甲醇為色譜純；水為重蒸水。

感冒清熱顆粒（廠家1，批號：1001171；廠家2，批號：0111428；廠家3，批號：EOF003；廠家4，批號：1001005；廠家5，批號：120103；廠家6，批號：101004；廠家7，批號：100861。規(guī)格均為每袋12 g）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水梯度洗脫（0 ～ 10 min，甲醇濃度由20%遞升至40%；10 ～ 15 min，甲醇濃度由40%遞升至75%，15 ～ 20 min甲醇濃度由75%遞減至65%，20 ～ 30 min甲醇濃度遞減至20%），檢測波長252 nm；柱溫為40 ℃；流速1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。理論塔板數按胡薄荷酮峰計算不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取胡薄荷酮對照品約3.929 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度[5]，搖勻，即得胡薄荷酮儲備液（78.6 μg·mL-1）；取葛根素對照品約0.013 83 g，精密稱定，用30%乙醇溶解稀釋至25 mL[6]，搖勻，即得葛根素儲備液（553.2 μg·mL-1）。再取胡薄荷酮儲備液、葛根素儲備液各8 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得到含胡薄荷酮12.573 μg·mL-1、葛根素88.512 μg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取感冒清熱顆粒適量，研細，取粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，經0.22 μm有機系微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照液 按處方比例稱取除葛根、荊芥穗、薄荷以外的其余藥味，按感冒清熱顆粒制備工藝制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照液。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，典型的色譜圖見圖1。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液并以甲醇為溶劑稀釋，得系列標準溶液。含葛根素分別為5.532、11.064、22.128、44.256、88.512 μg·mL-1；含胡薄荷酮分別為0.786、1.572、3.143、6.286、12.573 μg·mL-1，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）繪制標準曲線，計算回歸方程。葛根素Y= 38.445X+ 13.473，r= 1.000 0；胡薄荷酮Y= 29.912X- 1.808，r= 0.999 9。結果表明，葛根素在5.532 ～ 88.512 μg·mL-1、胡薄荷酮在0.786 ～12.573 μg·mL-1的范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.5 精密度實驗

按上述色譜條件，精密吸取含葛根素為22.128 μg·mL-1、胡薄荷酮為3.143 μg·mL-1的對照品溶液10 μL，連續(xù)重復進樣5次，記錄葛根素峰面積值分別為874.4，871.6，870.6，872.6，879.5，平均值為873.7，RSD為0.40%（n= 5）；胡薄荷酮峰面積值分別為81.5，81.5，81.7，80.8，82.8，平均值為81.7，RSD為0.89%（n= 5）。說明儀器的精密度良好。

圖1 感冒清熱顆粒中葛根素和胡薄荷酮的色譜圖

2.6 重復性實驗

取本品（批號0111428）粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按色譜條件檢測，精密吸取供試品溶液10 μL，注入色譜儀，共進樣5次，記錄葛根素峰面積值分別為1 845.6，1 882.2，1 855.7，1 804.5，1 801.1，平均值為1 837.8，RSD為1.89%（n= 5）；胡薄荷酮峰面積值分別為124.6，123.4，123.8，123.6，124.1，平均值為123.9，RSD為0.38%（n= 5）。結果表明，本方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取本品（批號0111428）粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按色譜條件，精密吸取供試品溶液10 μL，分別在0，4，8，12，16，24 h進樣。記錄葛根素峰面積值分別為1 845.6，1 855.7，1 804.5，1 801.1，1 825.0，1 807.5，平均值為1 823.2，RSD為1.26%（n=6）；胡薄荷酮峰面積值分別為124.6，123.8，123.6，124.1，123.6，123.5，平均值為123.9，RSD為0.34%（n= 6）。結果表明，供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

2.8 回收率實驗

2.8.1 葛根素回收率 取6份已知含量的感冒清熱顆粒（批號0111428）內容物適量，研細，每份約0.1 g，精密稱定，分別加入編號1 ～ 6的具塞錐形瓶中，分別精密加入0.4 mL葛根素對照品儲備液（濃度553.2 μg·mL-1），再精密加入19.6 mL甲醇，按供試品溶液制備方法，依色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計算回收率。結果平均回收率為100.73%，RSD為0.62%（n= 6）。具體見表1。

2.8.2 胡薄荷酮回收率 取6份已知含量的感冒清熱顆粒（批號0111428）內容物適量，研細，每份約1.3 g，精密稱定，分別加入編號1 ～ 6的具塞錐形瓶中，分別精密加胡薄荷酮對照品儲備液（濃度0.078 58 mg·mL-1）0.4 mL，再精密加入19.6 mL甲醇，按供試品溶液制備方法，依色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計算回收率。結果平均回收率為99.78%，RSD為0.75%（n= 6）。具體結果見表2。

2.9 樣品含量測定

分別取7個不同廠家的感冒清熱顆粒約1 g，精密稱定，用“2.2.2”方法制備，用“2.1”方法測定感冒清熱顆粒中葛根素和胡薄荷酮的含量；同時，采用本試驗方法進行感冒清熱顆粒中葛根素含量測定并與藥典[1]方法進行比較，結果見表3。

表1 葛根素回收率實驗測定結果. n = 6Tab 1 Results of recovery test for puerarin. n = 6

表2 胡薄荷酮回收率實驗測定結果. n = 6Tab 2 Results of recovery test for pulegone. n = 6

表3 不同測定方法下7個廠家感冒清熱顆粒中葛根素和胡薄荷酮的含量測定結果Tab 3 Contents of puerarin and pulegone in ganmao qingre granules from seven pharmaceutical factories by different methods

3 討論

3.1 溶劑的選擇

2010年版《中華人民共和國藥典》中葛根素含量測定的提取溶劑為30%乙醇[1]，本實驗供試品的提取溶劑分別采用30%乙醇和甲醇，并進行比較，結果葛根素含量無明顯差異，考慮到胡薄荷酮在甲醇中溶解性好，故本實驗供試品提取溶劑、胡薄荷酮對照品溶液以甲醇作為溶劑。

3.2 檢測波長的選擇

取對照品溶液，在200 ～ 400 nm范圍內掃描，胡薄荷酮和葛根素的最大吸收波長分別為252 nm和250 nm。由于感冒清熱顆粒中胡薄荷酮的含量比葛根素低，故采用252 nm作為測定波長。

3.3 流動相的選擇

我們對甲醇-水的比例分別為25∶75[7]、30∶70[8]、40∶60、50∶50[2]、65∶35、70∶30的流動相進行考察，結果甲醇濃度較高時，葛根素出峰時間在2 min左右，與雜質峰不能分離；甲醇濃度低時，胡薄荷酮在有效時間不出峰。綜合考慮，采用梯度洗脫，流動相中甲醇的濃度先低后高，使葛根素、胡薄荷酮出峰時間分別在10 min和20 min左右，分離度好，靈敏度高。

3.4 葛根素和胡薄荷酮的含量

不同廠家的感冒清熱顆粒中葛根素與胡薄荷酮的含量差異顯著。2010年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定感冒清熱顆粒中的葛根以葛根素計，每袋不得少于10.0 mg。但本文結果中，不同廠家的葛根素含量為每袋10.553 5 ～ 26.162 0 mg，相差一倍以上；7個廠家中只有一個廠家的感冒清熱顆粒中有胡薄荷酮的成分。葛根素與胡薄荷酮的含量受產地、采收季節(jié)、儲存時間、加工工藝等多因素影響，可能導致不同廠家生產的藥品有效成分含量差異顯著。成分含量的差異會導致不同廠家的產品之間臨床療效的差異。而現行標準對于胡薄荷酮既無鑒別又無含量測定方法，也是導致質量差異較大的原因。因此，應逐步完善和加強質量控制標準。

本試驗方法同時測定了葛根中的葛根素和薄荷與荊芥中的胡薄荷酮的含量，作為檢測感冒清熱顆粒的質量標準，具有較好的臨床意義。經比較，本法與藥典方法測定葛根素含量的差異不大，為感冒清熱顆粒的質量檢測提供了一種簡便、有效的方法。

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