鄧勝國尹愛武陳鐵壁

（湖南科技學(xué)院，湖南 永州 425100）

引 言

生姜(Zingiber Officinale Rosc.)是姜屬植物的塊根莖，屬國家衛(wèi)生部首批公布的藥食兼用資源之一，是我國重要的調(diào)味蔬菜和出口創(chuàng)匯蔬菜[1-2]。研究表明生姜含多種氨基酸、可溶性多糖、姜酚、黃酮等有效成分，具散寒、止嘔、健胃解毒、延緩衰老、降低膽固醇、抗癌和抑菌等功效[3-5]。目前對生姜的功能研究主要集中于姜酮、姜醇，而對生姜多糖類化學(xué)成分研究甚少，對于生姜多糖單體的提取、純化、化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定及生姜多糖與蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸等大分子相互作用的機(jī)制及生姜多糖抗氧化活性的研究國內(nèi)外文獻(xiàn)報道不多，影響了對生姜活性成分的利用和開發(fā)。因此建立生姜多糖初步提取分離條件，研究其清除自由基的作用，以期為后續(xù)多糖純化工序及進(jìn)一步探明生姜的生理作用機(jī)制及其功能食品的開發(fā)研究提供優(yōu)質(zhì)、有效的及豐富的原材料，提高生姜的綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

生姜：湖南省永州市零陵區(qū)楊梓塘菜市場購買。新鮮生姜洗凈、切片于50 ℃烘干，粉碎后加入石油醚通過索式裝置抽提至回流液近無色，脫去脂質(zhì)和色素的生姜粉，放入通風(fēng)櫥中風(fēng)干，待用。

苯酚 (AR)，濃硫酸 (AR)，95% 乙醇( AR)，葡萄糖 (GR)，抗壞血酸 (食品級)，水楊酸 (AR)，DPPH· (化學(xué)純)。

754紫外可見分光光度計 (上海光譜儀器有限公司) ；FZ-20植物粉碎機(jī) (上海勝啟儀器儀表有限公司；TGL - 20M高速臺式冷凍離心機(jī) (長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司) ；WG-20電熱鼓風(fēng)干燥箱 (天津市泰斯特儀器有限公司)；RE - 52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[6]

精密稱取在105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖10 mg置于100 mL的容量瓶中，加適量蒸餾水使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，混合均勻后加入濃硫酸4 mL，蒸餾水定容，室溫放置30 min后，在波長490 nm處測定吸光度(A)。以葡萄糖濃度(C，mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程A=6.0829C - 0.0011，R2=0.9953，如圖1.1。

圖1.1 苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1.1 The standard curve of enthrone-sulfate UV absorption used in glucose

1.2.2 生姜多糖的提取及測定

準(zhǔn)確稱取 5.000g的生姜粉，與一定體積的蒸餾水混合、攪拌均勻，恒溫水浴浸提一定時間真空抽濾，濾渣再用相同體積的蒸餾水第二次提取，過濾，合并濾液，濃縮定容至一定的體積供分析用。精密移取生姜多糖提取液2.0 mL于10 mL容量瓶中，按1.2.1的方法同樣處理后，在490 nm處測吸光度，根據(jù)回歸方程計算出提取液中生姜多糖的濃度并計算出生姜多糖的得率。

式中：C為生姜提取液中多糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為生姜提取液的總體積 (mL)，W為準(zhǔn)確稱取的生姜質(zhì)量(g)。

1.2.3 多糖提取的單因素實驗

1.2.3.1 提取溫度對生姜多糖提取率的影響

稱取5.000g的生姜粉末分別置于編號為1、2、3、4、5的具塞三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，分別在溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的水浴中恒溫提取2.5 h，測定生姜多糖的得率，比較選取最佳提取溫度。

1.2.3.2 提取時間對生姜多糖提取率的影響

稱取5.000g的生姜粉末分別置于編號為1、2、3、4、5的具塞三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，放入90 ℃恒溫水浴中分別提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，測定生姜多糖的得率，比較選取最佳提取時間。

1.2.3.3 料液比對生姜多糖提取率的影響

稱取5.000g的生姜粉末分別置于編號為1、2、3、4、5的具塞三角瓶中，按固液比分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25加入蒸餾水，放入90 ℃水浴中提取2.5 h，測定生姜多糖的得率，比較選取最佳料液比。

1.2.4 多糖提取的正交實驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對提取溫度、 提取時間和料液比采用 L9(34) 進(jìn)行正交試驗 (表1.1)，以多糖得率為考察指標(biāo)，優(yōu)化生姜多糖的提取工藝條件。

表1.1 生姜多糖提取正交試驗因素水平表Tab.1.1 Factors and levels list of orthogonal experiment for polysacchrides extraction

1.2.5 生姜多糖的抗氧化性研究

1.2.5.1 生姜多糖對·O H自由基清除作用(鄰菲羅啉法)

參照文獻(xiàn)[7]方法操作。向試管中加入一系列不同濃度的生姜多糖溶液1.00mL(空白管則加入1.00mL的蒸餾水)，F(xiàn)eSO4溶液2.00mL, 水楊酸-乙醇1.50 mL，最后加H2O2(0.03%)0.10 mL啟動反應(yīng)，振蕩混合，水浴37℃，保溫30min, 在波長510 nm 下測量各自的吸光度值。

其中，A0：空白管的吸光度；Ai：為加入自由基清除劑后的吸光度。

1.2.5.2 生姜多糖對DPPH· 的清除能力[27,28]

參照文獻(xiàn)[8-9]方法操作。反應(yīng)體積為4.0 mL，按表2-1加樣后，溶液搖勻，室溫下靜止30 min，乙醇調(diào)零，517 nm下測定各吸光值A(chǔ)（用等質(zhì)量濃度的抗壞血酸代替樣品做參照）。清除率 = [1－(Ai－Aj)／A0]×100%

表1.2 DPPH加樣實驗Table 1.2 The experiment about the addition of the DPPH -Free Radical

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對生姜多糖得率的影響

圖2.1 提取溫度對生姜多糖得率的影響Fig.2.1 The effect of temperature on extraction rate of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

由圖2.1可知，隨著溫度的升高，生姜多糖的得率逐漸增大，溫度大于90 ℃后，多糖的提取率增加緩慢。其原因可能是由于溫度的升高加速了多糖的擴(kuò)散和運(yùn)動而利于多糖分子克服生姜內(nèi)分子間約束而溶解于水中，致使其提取率上升。當(dāng)溫度超過90 ℃后，水對多糖的溶解度已達(dá)到飽和，溫度再升高對其提取率影響不明顯?？紤]到溫度升高對設(shè)備的特殊要求及防止多糖在高溫下發(fā)生部分水解等因素，因此選取90 ℃較為合理。

2.1.2 提取時間對生姜多糖得率的影響

由圖2.2可知，隨著提取時間的延長，生姜多糖的得率呈現(xiàn)增大趨勢，但在150 min后多糖的得率幾乎保持不變。表明多糖得率和提取時間密切相關(guān)，提取時間過短導(dǎo)致提取不充分，而150 min后多糖得率變化趨緩的原因可能是一方面提取時間延長導(dǎo)致生姜多糖在水溶液中溶解和擴(kuò)散達(dá)到平衡，另一方面是高溫長時間提取導(dǎo)致其他雜質(zhì)的溶解量增加，阻礙多糖類物質(zhì)的溶出。故綜合考慮選用150 min較為合適。

圖2.2 提取時間對生姜多糖得率的影響Fig.2.2 The effect of extraction time on extraction rate of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

2.1.3 液固比對生姜多糖得率的影響

由圖2.3可知，當(dāng)液固比低于20:1時，多糖含量隨液固比的增加而提高，但當(dāng)液固比大于20:1時，多糖含量則略有下降。其原因可能是隨著溶劑（水）量增加，多糖的溶解量增加，使生姜多糖的提取率上升；液固比達(dá)到20:1時，溶質(zhì)（多糖）的提取達(dá)到平衡，此時多糖的提取率最大；溶劑（水）量增加到一定程度（液固比大于20:1）時，導(dǎo)致多糖的水解速度增加，進(jìn)而影響多糖的提取率。由于提取液在后續(xù)工序中需經(jīng)濃縮，若初期加水量過大會使后續(xù)工序能耗增加，效率降低，因此選擇液固比為1:20左右較為適宜。

圖2.3 提取時料液比對生姜多糖得率的影響Fig.2.3 The effect of ratio of material to water on extraction rate of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

2.2 生姜多糖提取的正交試驗

表2.1 多糖提取正交試驗結(jié)果表Tab.2.1 The orthogonal experiments results of polysaccharides extraction

表2.2 多糖提取方差分析表Tab.2.2 Variance analysis of polysaccharides extraction

空列 0.07280 2 0.03640誤差 0.07280 2 0.03640總和 16.2994

由表2.1極差分析可知 ,影響生姜多糖得率的各因素主次關(guān)系為：B (料液比) > A(提取溫度) > C (提取時間) ，提取溫度和料液比均以第三水平為最佳，而提取時間則以第二水平為最好。從表3.2方差分析可知，料液比及提取溫度對生姜多糖得率的影響存在著顯著差異 (P < 0.01)，但提取時間對生姜多糖得率的影響不顯著。因此生姜多糖提取的最優(yōu)工藝參數(shù)組合應(yīng)為： A3B3C2，即提取溫度為90 ℃，提取時間為2.5 h，料液比為1:20。

2.3 生姜多糖抗氧化性研究

2.3.1 生姜多糖對羥自由基（· OH）的清除作用

圖2.4 生姜多糖對羥自由基的清除作用Fig.2.4 The hydroxyl radical scavenging potential of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

由圖2.4可以看出，生姜多糖提取液對由Fenton體系產(chǎn)生的·OH有一定的清除作用，隨著生姜多糖提取液濃度的增加，對·OH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當(dāng)提取液濃度達(dá)到1.0 mg/mL，提取液對羥自由基的清除作用達(dá)到48%。

圖2.5 生姜多糖對DPPH·自由基的清除作用Fig.2.5 The DPPH radical scavenging potential of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

2.3.2 生姜多糖對DPPH·清除能力

IC50值是評價自由基清除劑效果的常用指標(biāo)。IC50為半數(shù)抑制率濃度，即自由基清除率為50%時候自由基清除劑的濃度，其值越小，表示達(dá)到50%自由基清除率時，自由基清除劑的濃度劑量越小，其自由基清除效果越好[10]。由圖2.5可知，當(dāng)提取液濃度達(dá)到 1.0 mg/mL，對 DPPH·的清除率達(dá)到 56%，清除 DPPH·的 IC50為 0.93mg/mL，略小于抗壞血酸的 IC50值(0.85mg/mL)，說明在一定濃度范圍內(nèi)生姜多糖具有較強(qiáng)的清除DPPH·能力。

3 結(jié)論

1、正交實驗結(jié)果表明，料液比、提取溫度對生姜多糖的提取率有顯著性影響 ( P<0.01)，提取時間不顯著（P>0.01）。生姜多糖提取的最優(yōu)工藝參數(shù)組合為：液固比20: 1，提取溫度90 ℃、提取時間2.5 h；此工藝條件下生姜多糖的提取率為5.82%。

2、抗氧化性研究結(jié)果表明生姜多糖對·OH和DPPH·兩種自由基均有清除效果，并存在一定的量效關(guān)系。當(dāng)生姜多糖提取液濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，對·OH和DPPH·的清除率分別可達(dá)48%和56%，清除DPPH·的IC50為0.93mg/mL。

[1]李錄久, 劉榮樂, 陳防, 等.生姜的功效及利用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(30): 14656-14657,14696.

[2]吳曉慧, 顧龔平, 張衛(wèi)明, 等.姜綜合利用及深加工技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源, 2003, 22( 3): 5- 8.

[3]丁培峰, 吳文榮.姜汁、芒果汁復(fù)合飲料的研制[J].食品研究與開發(fā), 2010, 31(9): 110-112.

[4]劉雪梅.生姜的藥理作用研究進(jìn)展[J].中成藥, 2002, 24(7) : 539-541.

[5]楊洋.生姜黃酮的提取及其抗氧化活性的研究[J].食品科學(xué), 2002, 23(4): 45-50.[6] 方淑環(huán), 左紹遠(yuǎn).中藥多糖抗病毒作用及其作用機(jī)制[J].大理學(xué)院學(xué)報2006, 5(12): 67-70

[6]馬猛華, 崔波, 于海峰, 等.苯酚-硫酸法測定玫瑰花渣中多糖含量的研究[J].山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 2008, 22(4): 23-25.

[7]顏軍, 茍小軍, 鄒全付, 等.分光光度法測定 Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基[J].成都大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2009, 28(2):91-93,103.

[8]李順峰, 張麗華, 付娟妮, 等.真姬菇子實體多糖體外抗氧化特性研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2008, 17( 4) : 302-305.

[9]劉海英, 張運(yùn)峰, 范永山, 等.平菇、杏鮑菇和白靈菇菌絲多糖對·OH、DPPH·和 NO2-的體外清除作用[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2010, 26(17): 26-30.

[10]劉帥濤, 陶慧林, 李錦艷.4種黃酮小分子對 DPPH 自由基的清除作用及構(gòu)效關(guān)系研究[J].分析測試學(xué)報, 2012, 31(1):71-75.