牛乳中嗜冷菌檢測方法的研究進展

文 / 龐偉華

（黑龍江立高儀器設(shè)備有限公司）

隨著乳品加工業(yè)的發(fā)展，企業(yè)對生奶的需求量逐漸增加，為了防止生奶的變質(zhì)而廣泛采用冷藏方法來保存生奶。用這種方法保存生奶會導(dǎo)致生奶中嗜冷菌達到一定的數(shù)量。嗜冷菌可以抵御極端的寒冷環(huán)境，如南極的沿海冰層。嗜冷菌之所以可以在冰點下存活與繁殖，是因為它們有一種特殊的脂類細胞膜。這種細胞膜在化學(xué)上可以抵御由極寒帶來的硬化，使得其內(nèi)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出“抗凍能力”[1，2]。

嗜冷菌中最常見的品種有耶氏菌、李斯特菌和假單胞菌。人們對嗜冷菌的生長特點研究較少，主要集中在嗜冷菌所產(chǎn)生的酶的作用機制上。影響酶穩(wěn)定性的因素包括離子數(shù)量的增加、結(jié)構(gòu)大小和孔洞數(shù)量的減少，特定氨基酸的改變和亞基間疏水作用的增強等[3]。嗜冷菌對熱敏感，一般在UHT滅菌過程中被殺滅，但其代謝產(chǎn)生的酶耐熱，即使在超高溫滅菌140 ℃，5 s仍有殘留（蛋白酶的殘留量為29%，脂肪酶的殘留量為40%)。其中脂解酶大部分和酪蛋白結(jié)合，當(dāng)乳冷卻時從酪蛋白部分轉(zhuǎn)至脂肪，引起牛乳脂肪水解[4]。研究表明，當(dāng)生奶中嗜冷菌數(shù)量超過1×106CFU/mL時，產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶將導(dǎo)致超高溫產(chǎn)品發(fā)酸，出現(xiàn)脂肪氧化味。根據(jù)實際經(jīng)驗，生產(chǎn)UHT乳制品的生奶，嗜冷菌數(shù)需控制在1×103CFU/mL以內(nèi)[5]。國外早在20世紀80年代，在乳品生產(chǎn)過程中己經(jīng)建立了完善的嗜冷菌檢測體系。我國在乳品生產(chǎn)過程中，對嗜冷菌的控制還沒有引起足夠的重視。近年來由食品衛(wèi)生問題而導(dǎo)致的多起消費事件，導(dǎo)致人們對食品的安全性提出了更高的要求，對嗜冷菌的關(guān)注度也逐漸提高。

1 嗜冷菌的耐低溫特性

嗜冷菌由于其細胞結(jié)構(gòu)、生物大分子等對低溫有較強的適應(yīng)能力，因此在低溫下能生長。嗜冷菌細胞膜中脂類含量較多[6]，有助于其在低溫條件下吸收環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)。而且其中含有較多不飽和脂肪酸[7]，降低了脂類的溶點。低溫條件下，嗜冷菌可以通過改變細胞外膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使通道孔徑縮小，避免有毒物質(zhì)進入體內(nèi)。嗜冷菌中二氫脲嘧啶含量高，有助于tRNA局部構(gòu)象，有較好的柔性以及動力學(xué)上較好的流動性，以適應(yīng)低溫。嗜冷菌所產(chǎn)低溫酶的分子結(jié)構(gòu)一般具有較高的柔性，在低溫條件下能快速進行構(gòu)象上的調(diào)整以適應(yīng)催化反應(yīng)的需要，減少能量消耗，進而使嗜冷菌保持正常生長所需的新陳代謝活動[8]。當(dāng)嗜冷菌所處環(huán)境溫度由21 ℃降到5 ℃時，細胞內(nèi)可產(chǎn)生26 種冷休克蛋白。冷休克蛋白的作用可能是通過與DNA和RNA相互作用來促進一些嗜冷菌在低溫條件下生長所需蛋白質(zhì)的合成[9]。

2 嗜冷菌對原料奶的危害分析

嗜冷菌主要來源于外源性污染，如牛體、奶站環(huán)境、擠奶器具、冷藏奶及運奶的器具、工作人員的衛(wèi)生狀況等，管理對嗜冷菌的控制有較大影響。原料奶中以兼性嗜冷菌為主，目前從原料奶中分離到的嗜冷菌有假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、無色桿屬、黃桿菌屬和克雷伯氏桿菌屬等[10]。對這些菌株進行特性分析后發(fā)現(xiàn)，它們都會對原料奶的保存產(chǎn)生危害。如假單胞菌，具有強力分解脂肪和蛋白質(zhì)的能力，可使脂肪分解從而產(chǎn)生脂肪哈敗味，可將原料奶中的蛋白質(zhì)分解成蛋白胨；產(chǎn)堿桿菌，其本身不能分解原料奶中的糖類產(chǎn)酸，但其能產(chǎn)生灰黃色、棕黃色的色素，并可使原料奶中所含的有機鹽分解而形成碳酸鹽，從而使原料奶轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性，并能導(dǎo)致乳制品產(chǎn)生粘性變質(zhì)?？傊壤渚芷茐脑夏讨械某煞?，主要是由于嗜冷菌可以產(chǎn)生使脂肪、蛋白質(zhì)分解的耐熱脂肪酶、蛋白酶[11]。另外，嗜冷菌在有氧低溫下可進行生色反應(yīng)，如黃色、綠色、奶油色、金色、紅色、棕褐色和黑色等。在原料奶運輸和儲存過程中，攪拌和長時間搖晃能使嗜冷菌生長速度加快，所以在制冷運輸過程中應(yīng)該盡量避免長時間攪拌和反復(fù)入罐；在條件允許的情況下，盡量將牛奶的制冷溫度調(diào)整至2 ℃儲存，將牛奶運輸?shù)綇S的溫度控制在4 ℃以下。這樣可以有效控制嗜冷菌的繁殖，提高原料奶質(zhì)量；同時，盡量縮短原料奶的儲存時間，在現(xiàn)有條件下將24 h到廠時間縮減至16 h左右，也是控制嗜冷菌繁殖的有效手段。

3 嗜冷菌對UHT奶的危害分析

嗜冷菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性胞外降解性酶類在巴氏殺菌過程中基本不受影響，經(jīng)過UHT處理后仍能保持部分活性，導(dǎo)致UHT乳蛋白凝塊和乳清析出。隨著UHT乳貯存時間延長，首先會出現(xiàn)少量小凝塊，然后逐漸增大并沉于底部，而上部則析出少量的乳清液。這主要是酶水解乳蛋白引起的，主要水解κ-CN生成副-κ-CN，從而失去了κ-CN對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用，使蛋白質(zhì)聚集，最終由于自身重力作用沉于底部，隨時間的延長，并逐漸析出乳清[12]，同時產(chǎn)品發(fā)苦，在水解過程中釋放的氨基酸會使褐變反應(yīng)加劇。脂肪酶分解原料奶中的脂肪球，產(chǎn)生游離的短鏈脂肪酸使原料奶酸度升高導(dǎo)致腐敗，由于游離脂肪酸的增加，導(dǎo)致脂肪上浮，乳制品風(fēng)味變差，產(chǎn)生乳酪味、腐爛味、肥皂味、不潔味或酵母味等[13]。這些由嗜冷菌產(chǎn)生的脂肪酶、蛋白酶還會造成片式熱交換器的淤塞，使清洗困難。

4 國內(nèi)外嗜冷菌檢測方法研究現(xiàn)狀

由于原料奶中嗜冷菌對高溫殺菌的乳制品影響較大，因此對于原料奶中嗜冷菌的檢驗是非常重要的。IDF Standard 101A中嗜冷菌數(shù)的檢測方法為：將原料奶在5~7 ℃培養(yǎng)10 天后計數(shù)；IDF Standard 132A中嗜冷菌數(shù)的檢測方法為：將樣品在21 ℃下增菌培養(yǎng)后，采用選擇性培養(yǎng)基在21 ℃培養(yǎng)25 h后，將樣品中革蘭氏陰性桿菌作為嗜冷菌污染的指標。但這些方法所需的檢測時間長，因此對原料奶的收購沒有指導(dǎo)性意義。因此，國外研究者不斷對嗜冷菌的檢測方法進行研究和改進，以期得到既快速又準確，而且適合工業(yè)化應(yīng)用的檢測方法。

4.1 PCR-ELISA法

Gutiérrez等在20世紀90年代將PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)結(jié)合用于測定冷藏牛奶中細菌的數(shù)量。他們找出了一個廣泛存在于冷藏原料奶中的微生物中的DNA片段。實驗表明，當(dāng)細菌數(shù)在103～107CFU/mL時，PCR-ELISA檢測方法中樣品的DNA擴增吸光度效果最好，而且在測定4 ℃下保存的原料奶中嗜冷菌的數(shù)量時，與傳統(tǒng)的標準平板計數(shù)培養(yǎng)法之間存在很高的相關(guān)系數(shù)（r=0.94，p＜0.001）[14]。PCRELISA方法最突出的優(yōu)勢在于節(jié)省時間，該方法檢測全部樣品需要的時間為24 h。PCR-ELISA方法具有很高的特異性和敏感度。Sharpe等[15]和Fung等[16]認為PCR-ELISA這種基于免疫學(xué)和基因技術(shù)的方法提供了一種互補的、創(chuàng)新的途徑來檢測食品中的微生物，不但減少了分析的時間，而且仍然可以保持高的可靠性和敏感度。

4.2 氧化還原法

用選擇性試劑二氯甲基苯翁和細菌指示劑四唑鹽混合在一起在30 ℃培養(yǎng)，四唑鹽會被還原，使樣品奶的顏色變成紅色。變色需要的時間決定樣品奶中低溫菌的數(shù)量與存在的活性[17]。

4.3 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

此方法是基于酶反應(yīng)的一種高特異性和高靈敏性的檢測方法，它可以從復(fù)雜的樣品體系中特異地與目標反應(yīng)物結(jié)合，從而達到檢出的目的。Rosalba等利用單克隆抗體和間接ELISA的方法測定了冷藏奶中的嗜冷菌，并且與嗜冷菌的平板計數(shù)法進行比較。實驗結(jié)果表明，測定4 ℃下保存的成品奶樣品中嗜冷菌，平板計數(shù)法和ELISA方法之間存在非常好的相關(guān)系數(shù)[18]。

4.4 氨肽酶法

Susana等測定了冷藏原料奶的微生物。他們用無色L-丙氨酸-p-對硝基苯胺作為底物，通過嗜冷菌細胞壁的氨肽酶的作用使其裂解成p-硝基苯胺（黃色），最后用紫外分光光度計測定吸光度，間接反映樣品中嗜冷菌的數(shù)量。實驗結(jié)果表明，氨肽酶法和傳統(tǒng)的微生物計數(shù)方法之間存在很高的相關(guān)性，所需的檢測時間約為2.5 h，儀器和實驗操作簡單[19]。

4.5 脂肪酶活性的測定

任靜等研究出了一種新的檢測方法。方法的原理為：嗜冷菌能在奶中產(chǎn)生大量耐熱性脂肪酶，在脂肪酶和嗜冷菌之間建立一種線性關(guān)系，利用4-硝基苯酚游離釋放法測定脂肪酶的活力，從而間接反映嗜冷菌的數(shù)量。實驗結(jié)果表明，總菌數(shù)和酶活之間存在的線性關(guān)系極顯著[20]。

5 結(jié)語

為了生產(chǎn)高質(zhì)量的乳制品，原料奶中的嗜冷菌的檢驗是尤為重要的。開發(fā)快速、準確、操作簡單、價格低廉的嗜冷菌檢驗方法是未來乳品企業(yè)重點研究的課題之一。檢驗方法的開發(fā)是保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵，但是卻增加了生產(chǎn)成本，并且具有滯后性，而且不能指導(dǎo)高質(zhì)量原料奶的生產(chǎn)和加工，因此，對于原料奶的早期生產(chǎn)控制更是乳品行業(yè)最需要考慮的問題。

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