賀巧鳳（湖南省長(zhǎng)沙市三醫(yī)院檢驗(yàn)科 410015）

乙型肝炎病毒（HBV）血清標(biāo)志物是臨床判斷患者病情和傳染性的重要依據(jù)之一。能夠反映狀態(tài)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床診斷和治療，它能夠直接檢測(cè)HBV-DNA的水平，反映HBV的感染活性。本文通過(guò)檢測(cè)乙型肝炎患者血清病毒標(biāo)志物和血清中病毒的含量，將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討二者的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2009年1月至2011年12月在本院就診同時(shí)做乙型肝炎兩對(duì)半和乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）檢測(cè)的門診和住院的乙型肝炎感染者，共681例，其中男416例，女265例，年齡4～71歲。

1.2 主要試劑 HBV-DNA定量診斷試劑由杭州博日科技有限公司提供。乙型肝炎（下稱乙肝）患者血清病毒標(biāo)志物測(cè)定用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），試劑由上?？迫A生物工程公司提供。

1.3 檢測(cè)方法 ELISA按試劑說(shuō)明書進(jìn)行，用Bio-Red酶標(biāo)儀測(cè)定和記錄結(jié)果；HBV-DNA載量檢測(cè)儀器采用美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的ABI7500熒光定量PCR檢測(cè)儀，操作嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。污染的控制標(biāo)本的處理、試劑的配制、上樣及PCR擴(kuò)增檢測(cè)嚴(yán)格分室進(jìn)行，每次檢測(cè)均設(shè)強(qiáng)陽(yáng)性、臨界陽(yáng)性、陰性、質(zhì)控試劑參照品。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

681例按乙肝病毒標(biāo)志物（HBV-M）常見(jiàn)模式分成10組，分別統(tǒng)計(jì)HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性率和測(cè)定值均以大于103copy／mL為界限值。乙肝病毒e抗原（HBeAg）陽(yáng)性標(biāo)本（①，③組）HBV-DNA 陽(yáng)性率分別為94.9%和94.3%，與HBeAg陰性標(biāo)本組HBV-DNA陽(yáng)性率為0%～58.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 HBV-DNA及HBV-M結(jié)果比較

3 討 論

HBV感染的病原學(xué)診斷主要依靠免疫血清學(xué)方法檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物和分子生物學(xué)方法檢測(cè)HBV核酸。HBV血清學(xué)標(biāo)志物主要反映的是人體對(duì)乙肝病毒的免疫狀態(tài)，而HBV-DNA是病毒復(fù)制活動(dòng)最直接和可靠的標(biāo)志，也是HBV感染最為直接的證據(jù)。對(duì)于乙肝血清標(biāo)志物與HBV-DNA的關(guān)系，近年來(lái)國(guó)內(nèi)曾有多篇研究報(bào)道［1－2］，表1結(jié)果顯示，第1組和第3組，HBV-DNA檢出率最高（94.9%和94.3%），且拷貝測(cè)定值最高，與國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的報(bào)道相似［3－4］；第1組和3組都含有HBsAg和HBeAg陽(yáng)性，HBV-DNA陽(yáng)性率顯著高于其他組。HBsAg是HBV感染后第1個(gè)出現(xiàn)的血清學(xué)標(biāo)志物，HBsAg陽(yáng)性表示存在HBV感染。HBeAg是HBV活動(dòng)性復(fù)制的指標(biāo)之一，HBeAg陽(yáng)性表示病毒在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制活躍，傳染性強(qiáng)，對(duì)肝細(xì)胞破壞嚴(yán)重。有研究發(fā)現(xiàn)，HBV-DNA與HBeAg和HBsAg存在相關(guān)性，但其濃度間并不呈正線性相關(guān)。HBeAg陽(yáng)性的標(biāo)本，HBV-DNA通常有較高的拷貝濃度，從表1中可以看出，HBeAg陽(yáng)性患者的HBV-DNA濃度明顯高于HBeAg陰性患者的 HBV-DNA濃度。抗-HBe出現(xiàn)于HBeAg轉(zhuǎn)陰后，抗-HBe出現(xiàn)表示病變趨向好轉(zhuǎn)，病毒復(fù)制水平降低，病變趨于靜止，血中HBV-DNA濃度較低或陰性。從表1的檢測(cè)結(jié)果可以看出有的“小三陽(yáng)”即HBeAg陰性而抗－HBe陽(yáng)性的患者HBV-DNA濃度也較高，那是由于HBV基因組前C區(qū)發(fā)生突變時(shí)，使HBeAg無(wú)法檢出，此時(shí)HBV復(fù)制仍活躍，HBV-DNA濃度也較高，病變可持續(xù)進(jìn)展。但在HBeAg陽(yáng)性者中仍有部分HBV-DNA為陰性，這可能與血清HBVDNA復(fù)制水平低或病毒發(fā)生變異有關(guān)［5］，但其中有38例HBV-DNA為陰性，而其他文獻(xiàn)［6－7］也顯示大三陽(yáng)中 HBVDNA并非100%，其原因?yàn)闊晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)（FQ-PCR）只能檢測(cè)血中游離的HBV-DNA，當(dāng)病毒整合到肝細(xì)胞染色體上，隨同肝細(xì)胞一起復(fù)制、表達(dá)，ELISA可出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，但血清中卻并不存在乙肝病毒顆粒，而導(dǎo)致FQ-PCR結(jié)果為陰性；另外當(dāng)感染的HBV-DNA發(fā)生突變時(shí)，不能與熒光探針結(jié)合，F(xiàn)Q-PCR結(jié)果亦為陰性，而ELISA可為陽(yáng)性。因此對(duì)于ELISA結(jié)果為大三陽(yáng)而HBV-DNA為陰性者，應(yīng)做具體分析，確定是什么原因所致。

一直認(rèn)為，HBeAg陰性提示血清 HBV-DNA復(fù)制水平低，傳染性或病情趨向穩(wěn)定或恢復(fù)。但在本研究中發(fā)現(xiàn)第2組、4組、5組、7組 HBeAg陰性，336例標(biāo)本中出現(xiàn)138例HBV-DNA陽(yáng)性，表明即使體內(nèi)有多種抗體產(chǎn)生，部分患者仍具有病毒的復(fù)制與傳染性，這可能與HBV發(fā)生前C區(qū)基因突變、機(jī)體發(fā)生特異性的免疫耐受有關(guān)。如果僅以HBeAg的檢測(cè)結(jié)果作為判斷HBV感染、傳染性以及HBV是否在體內(nèi)復(fù)制有一定的局限性，因此，應(yīng)選擇檢測(cè)HBV-DNA作為體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)。

研究發(fā)現(xiàn)，第5組 HBsAg陰性（抗-HBe、抗-HBc均陽(yáng)性），仍發(fā)現(xiàn)有14.3%的 HBV-DNA陽(yáng)性，且拷貝數(shù)在104copy／mL左右。其原因可能由于：①HBV發(fā)生變異，其前S區(qū)變異率比S區(qū)高2倍；前C／C區(qū)變異研究較多。②HBsAg的表達(dá)可能較低或其抗原性改變較大，用現(xiàn)有的試劑檢測(cè)不出。③形成免疫復(fù)合物，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血中免疫復(fù)合物的存在可能影響 HBsAg的檢出［8］。第2，4，6組，雖然 HBV-DNA陽(yáng)性率低于1組和3組，但陽(yáng)性率仍然較高，說(shuō)明雖然HBeAg陰性，但病毒并沒(méi)有停止復(fù)制，只是復(fù)制減緩或部分患者出現(xiàn)病毒基因變異。這樣的感染更易對(duì)患者造成傷害，嚴(yán)重者可發(fā)展為肝硬化或肝癌［9］。第7組僅HBsAg陽(yáng)性的72例感染者中有30例HBV-DNA陽(yáng)性，檢出率為41.7%，這可能是HBV活躍的早期，血清中其他標(biāo)志物還沒(méi)有出現(xiàn)，因此這種病例亦可能具有較高的傳染性。有文獻(xiàn)報(bào)道［10］，乙肝病毒血清標(biāo)志物各種表現(xiàn)形式均可能存在不同程度的HBV復(fù)制，只是因時(shí)間短，有些表現(xiàn)形式可能由于檢測(cè)數(shù)量、檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑差異等原因?qū)е履承┍憩F(xiàn)模式檢出率低。

因此，采用FQ-PCR檢測(cè)乙肝病毒感染者 HBV-DNA含量，同時(shí)采用ELISA測(cè)定乙肝病毒標(biāo)志物，有助于了解患者病毒復(fù)制水平，對(duì)乙肝的臨床診斷，特別是為抗病毒治療方案的選擇提供科學(xué)依據(jù)［11］。同時(shí)，在抗病毒治療后HBV-DNA轉(zhuǎn)陰的患者，檢測(cè)HBeAg／抗-HBe動(dòng)態(tài)消長(zhǎng)過(guò)程，觀察 HBsAg的變化，有助于判斷治療終點(diǎn)和調(diào)整治療方案［12］。

由此可見(jiàn)，僅依靠乙肝病毒血清標(biāo)志物檢測(cè)診斷HBV感染是不夠的，它只能較好地反映機(jī)體對(duì)HBV感染的免疫應(yīng)答狀況，而FQ-PCR可以定量檢測(cè) HBV-DNA濃度，且靈敏度高、特異性強(qiáng)，更能清楚地反映乙肝患者的病毒活動(dòng)程度，真實(shí)地反映HBV的感染和復(fù)制情況。只有將兩種檢測(cè)方相結(jié)合對(duì)乙肝患者進(jìn)行綜合分析，才能對(duì)臨床診斷、治療方案設(shè)計(jì)及藥物療效觀察提供可靠的依據(jù)。

［1］ 黃增相，陳丹陽(yáng)，張清波.乙型肝炎病毒DNA定量與血清病毒標(biāo)志物的關(guān)系［J］.中華肝臟病雜志，2004，12（1）：43.

［2］ 王敏甲，王芙蓉.乙型肝炎血清標(biāo)志物與HBV-DNA定量的關(guān)系探討［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2006，35（11）：1527-1528.

［3］ 黃其俊.乙肝免疫標(biāo)志物與HBV-DNA的相關(guān)性及聯(lián)合檢測(cè)的臨床價(jià)值［J］.臨床輸血與檢驗(yàn)2008，10（4）：353-355.

［4］ 郭輝，閔娟，葉健忠.乙型肝炎病毒DNA與血清免疫標(biāo)志物的關(guān)系分析［J］.華中醫(yī)學(xué)雜志2007，31（3）：207-209.

［5］ Noborg U，Gusdal A，Horal P，et al.Levels of viraemia in subjects with serological markers of past or chronic hepatitis B virus infection［J］.Scandinavian journal of infectious diseases 2000，32（3）：249-252.

［6］ 陳小晶，王奕忠，鄭映玉，等.乙肝病毒載量與血清標(biāo)志物定量的相關(guān)性［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2009，30（2）：239-241.

［7］ 蔡惠興，吳英，梁鵬.乙肝血清標(biāo)志物與HBV-DNA定量檢測(cè)結(jié)果分析［J］.國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2010，16（2）：218-219.

［8］ 田庚善.傳染病學(xué)［M］.3版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998：237-260.

［9］ 梅小平，李健，曾躍，等.乙型肝炎病毒HBV DNA與臨床分析［J］.中華肝病雜志，2004，22（5）：313.

［10］陳平.11 252例乙肝血清標(biāo)志物與HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果分析［J］.青海醫(yī)藥雜志，2006，36（12）：54-55.

［11］秦恩強(qiáng)，王福生.持續(xù)ALT正常、HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者的預(yù)后與HBV DNA水平的關(guān)系［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2009，16（5）：106.

［12］謝士達(dá)，劉成永，高金玉，等.HBeAg和抗-HBe血清轉(zhuǎn)換的動(dòng)態(tài)變化對(duì)拉米夫定療效的評(píng)價(jià)［J］.肝臟，2005，10（4）：305-317.