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(1.江蘇省泰州市姜堰區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇泰州 225500； 2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司)

牛奶中的抗生素含量會(huì)影響牛奶的進(jìn)一步發(fā)酵加工，許多國家及聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)等國際機(jī)構(gòu)都作出規(guī)定：奶牛在接受抗生素治療期間及用藥后數(shù)日內(nèi)的乳汁不得用于生產(chǎn)商品乳[1,2]。盡管如此，仍有部分農(nóng)場或奶農(nóng)無視相關(guān)規(guī)定，向乳品加工企業(yè)提供含有抗生素的原奶。因此，對(duì)乳品加工企業(yè)來說，抗生素已成為原奶收購環(huán)節(jié)中必不可少的檢測項(xiàng)目[3]。

大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素四聯(lián)膠體金快速檢測試紙條，是以膠體金技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)的一種靈敏度高、檢測時(shí)間短、準(zhǔn)確度高、易貯存、攜帶方便、現(xiàn)場操作簡便、可一次檢測4種抗生素的快速檢測產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于牛奶收購、流通、生產(chǎn)、銷售等環(huán)節(jié)的牛奶中抗生素篩查，10 min內(nèi)就可檢測出結(jié)果。本試驗(yàn)對(duì)大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素四聯(lián)膠體金快速檢測試紙條的檢測限、特異性、重復(fù)性、假陽性率、假陰性率以及影響膠體金檢測效果的主要因素等方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 試驗(yàn)材料

大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素四聯(lián)膠體金快速檢測試紙條由北京某生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)H20120913B20。 牛奶樣本 購自超市。大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素及其他抗生素標(biāo)準(zhǔn)品由sigma公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1檢測方法與結(jié)果判斷 采用微量移液器吸取200 μL待檢牛奶樣品于凍存有膠體金標(biāo)記抗體的微孔中，緩慢抽吸至牛奶充分與微孔中試劑混勻。將試紙條插入微孔中-印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中。 室溫(20～25 ℃)孵育5 min后，取出試紙條觀察顏色，判定結(jié)果。

陰性(-)：C線顯色，T線顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣本中大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素濃度低于檢測限。

陽性(+)：C線顯色，T1線不顯色，表示牛奶樣本中大觀霉素濃度等于或高于檢測限； C線顯色，T2線不顯色，表示牛奶樣本中鏈霉素濃度等于或高于檢測限； C線顯色，T3線不顯色，表示牛奶樣本中慶大霉素濃度等于或高于檢測限； C線顯色，T4線不顯色，表示牛奶樣本中新霉素濃度等于或高于檢測限(詳見圖1)。

無效：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙條已失效。

圖1 試紙條檢測結(jié)果判定

2.2最低檢測限試驗(yàn) 將不同濃度的大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加的牛奶樣品分為5組，每組樣品10份，其中大觀霉素各組濃度分別為5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L、25 μg/L；慶大霉素各組濃度分別為5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L、25 μg/L；新霉素各組濃度分別為200 μg/L、300 μg/L、400 μg/L、500 μg/L、600 μg/L；鏈霉素各組濃度分別為20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L、80 μg/L、100 μg/L。分別用試紙條檢測，5 min后觀察結(jié)果。

2.3特異性試驗(yàn) 將牛奶中常見的其他抗生素(青霉素G、頭孢洛寧、四環(huán)素、紅霉素、林可霉素、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶)添加到陰性牛奶樣品中，使其終濃度為500 μg/L，分別用試紙條重復(fù)檢測5次，5 min后觀察結(jié)果。

2.4重復(fù)性試驗(yàn) 分別用添加大觀霉素20 μg/L、慶大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、鏈霉素80 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的陽性牛奶和陰性牛奶各1份，分別用試紙條進(jìn)行重復(fù)檢測20次，5 min后觀察結(jié)果。

2.5不同溫度檢測 分別用添加大觀霉素20 μg/L、慶大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、鏈霉素80 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的陽性和陰性牛奶各5份，分別在室溫條件下(25℃)、培養(yǎng)箱(37℃)和冰箱(4℃)中用試紙條進(jìn)行檢測， 5 min后觀察結(jié)果。

2.6不同濕度檢測 分別用添加大觀霉素20 μg/L、慶大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、鏈霉素80 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品陽性牛奶和陰性牛奶各5份，分別在氣候箱中相對(duì)濕度為30%～40%， 60%～70%，85%～90%時(shí)用試紙條檢測，5 min后觀察結(jié)果。

2.7假陽性率 隨機(jī)用陰性牛奶樣品50份，用試紙條檢測，5 min后觀察結(jié)果，以考察試紙條的假陽性率。

2.8假陰性率 隨機(jī)用添加大觀霉素20 μg/L、慶大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、鏈霉素80 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的陽性牛奶樣品50 份，用試紙條檢測，5 min后觀察結(jié)果，以考查試紙條的假陰性率。

3 結(jié)果與分析

3.1試紙條最低檢測限 牛奶中大觀霉素含量<15 μg/L時(shí)，均出現(xiàn)陰性結(jié)果，≥20 μg/L時(shí)，均出現(xiàn)陽性結(jié)果，15 μg/L時(shí)，檢測10份樣品中有1份出現(xiàn)陽性結(jié)果，檢出率為10%；慶大霉素含量<15 μg/L時(shí)，均出現(xiàn)陰性結(jié)果，≥20 μg/L時(shí)，均出現(xiàn)陽性結(jié)果，15 μg/L時(shí)，檢測10份樣品中有2份出現(xiàn)陽性結(jié)果，檢出率為20%；新霉素含量≤400 μg/L時(shí)，均出現(xiàn)陰性結(jié)果，≥500 μg/L時(shí)，均出現(xiàn)陽性結(jié)果；鏈霉素含量≤60 μg/L時(shí)，均出現(xiàn)陰性結(jié)果，≥80 μg/L時(shí)，均出現(xiàn)陽性結(jié)果(詳見表1)。為避免在實(shí)際應(yīng)用中出現(xiàn)假陰性結(jié)果，給乳制品企業(yè)帶來潛在威脅，在本試驗(yàn)條件下試紙條的最低檢測限規(guī)定為：大觀霉素20 μg/L；慶大霉素20 μg/L；新霉素500 μg/L；鏈霉素80 μg/L。

表1 不同濃度抗生素牛奶檢測結(jié)果

3.2特異性試驗(yàn) 分別對(duì)添加500 μg/L青霉素G、頭孢洛寧、四環(huán)素、紅霉素、林可霉素、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶的牛奶樣品進(jìn)行檢測，檢測線和質(zhì)控線均顯色，結(jié)果為陰性，所以試紙條特異性較好。

3.3重復(fù)性試驗(yàn) 陽性牛奶與陰性牛奶重復(fù)檢測結(jié)果見表2。 結(jié)果顯示，所檢樣品中，只有1份陰性牛奶樣品在進(jìn)行慶大霉素檢測時(shí)出現(xiàn)陽性結(jié)果，總體陰性牛奶與陽性牛奶重復(fù)檢測結(jié)果均一，表明該試紙條重復(fù)性較好。

表2 試紙條重復(fù)性檢測

3.4溫度影響 不同溫度條件下的檢測結(jié)果，詳見表3。 結(jié)果表明，在25℃條件下進(jìn)行檢測，未出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；在37℃或4℃，出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，但影響并不顯著。

表3 溫度的影響試驗(yàn)

3.5濕度影響 不同濕度條件下的檢測結(jié)果，詳見表4。 結(jié)果表明，在相對(duì)濕度60%～70%條件下進(jìn)行檢測，未出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；在相對(duì)濕度30%～40%和85～90%條件下檢測，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，尤其在相對(duì)濕度85%～90%時(shí)，影響顯著。

表4 濕度的影響試驗(yàn)

3.6假陽性率試驗(yàn) 檢測50份陰性牛奶，結(jié)果48份呈陰性，2份呈陽性，即假陽性率為4%。

3.7假陰性率試驗(yàn) 檢測50份陽性牛奶，結(jié)果均呈陽性。

4 討 論

經(jīng)試驗(yàn)表明，環(huán)境溫度對(duì)檢測結(jié)果有一定影響，在普通實(shí)驗(yàn)室溫度結(jié)果顯示良好。主要是由于試紙條所需牛奶樣品量很少，高溫時(shí)牛奶中的水分容易蒸發(fā)，低溫時(shí)牛奶中的水分流動(dòng)性變差，從而影響檢測結(jié)果，所以使用試紙條檢測時(shí)推薦在室溫(25℃)進(jìn)行。50%～70%濕度條件下檢測結(jié)果良好。

本試驗(yàn)中，試紙條沒有出現(xiàn)假陰性，符合檢驗(yàn)要求。由于牛奶檢測的影響因素甚多，如采樣時(shí)間，所留標(biāo)本時(shí)間長短，提供標(biāo)本者的飲食情況，以及檢測時(shí)的環(huán)境條件，都將影響檢測結(jié)果，尤其是牛奶樣本成分復(fù)雜，特別是在含有所檢抗生素結(jié)構(gòu)相近的代謝物時(shí)，都將導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。由于試紙條主要用于篩選，可以允許一定的假陽性率，所以出現(xiàn)4%的假陽性率屬可接受范圍之內(nèi)。

根據(jù)有關(guān)資料，經(jīng)抗生素治療的奶牛必須有最短2d，最長45d的休藥期，休藥期之后所產(chǎn)鮮奶方可出售或作為乳制品加工原料乳[4]。所以經(jīng)抗生素治療的奶牛，其所產(chǎn)牛奶在休藥期內(nèi)禁止在市場上出售或作為乳制品加工原料乳，由于利益驅(qū)使，僅僅依靠生產(chǎn)單位的自我約束力是不夠的，收購單位在收購牛奶時(shí)應(yīng)對(duì)牛奶中殘留抗生素進(jìn)行檢測和監(jiān)控[5,6]。

大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素四聯(lián)膠體金快速檢測試紙條由于具有準(zhǔn)確度高、檢測時(shí)間短、攜帶方便、無需儀器和洗滌步驟等優(yōu)點(diǎn)，因此大大地提高了檢測效率，十分適合現(xiàn)場快速檢測，作為一種快速篩查的手段可以有效地彌補(bǔ)廣大基層單位因設(shè)備和經(jīng)費(fèi)問題而無法開展食品中大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素的檢測和監(jiān)控，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

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