孫大貴， 劉作華， 李文坡， 陳昌國

(重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400044)

0 引言

高效液相色譜法(HPLC)具有分離效能高、選擇性好、檢測靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)，已經(jīng)成為商品檢驗(yàn)、環(huán)境科學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域科學(xué)研究、科學(xué)鑒定的重要分離分析手段[1]，被列為高校本科及研究生儀器分析實(shí)驗(yàn)課程的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一[2-3]。但幾乎都是在固定色譜條件下進(jìn)行定量分析的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式，缺乏創(chuàng)造性的探索過程。且實(shí)驗(yàn)課時(shí)有限，一般只有4～8學(xué)時(shí)，學(xué)生對HPLC分析方法只能走馬觀花，達(dá)不到良好的教學(xué)效果[4]。

高效液相色譜儀屬于大型精密儀器，數(shù)量有限，運(yùn)行、維護(hù)成本高，對實(shí)驗(yàn)操作的技能技巧要求較高，所以，對教師和學(xué)生的開放程度相對有限[5-6]?！疤摂M實(shí)驗(yàn)室”的開發(fā)應(yīng)運(yùn)而生，成為眾多高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)，尤其是儀器分析課程教學(xué)改革的新發(fā)展方向之一[7]。但卻失去了師生之間面對面互動(dòng)式的教學(xué)相長機(jī)會(huì)，更不可能達(dá)到熟練操作的目的[8]。因此，很有必要設(shè)計(jì)具有啟發(fā)式、探究式、討論式、科研與教學(xué)互動(dòng)的HPLC教學(xué)實(shí)驗(yàn)[9]。

由于科研工作的需要，作者探索了用高效液相色譜法測定混合鄰苯二甲酸酯的方法[10-11]，并將其改編成儀器分析的研究式教學(xué)實(shí)驗(yàn)。具體包括了色譜柱效的測定、色譜條件優(yōu)化、定量分析3個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，其中“色譜條件優(yōu)化”最具代表性。

1 實(shí)驗(yàn)器材

(1)儀器。Agilent 1100高效液相色譜儀，色譜柱Hypersil ODS(4.6 mm×150 mm)，固定相顆粒度5 μm，MWD檢測器，高壓六通進(jìn)樣閥，定量管20 μL。

(2)流動(dòng)相。乙腈(色譜純)，超純水。

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液。濃度均為10 μg/L的鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)，鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)溶液。均為分析純。

2 教學(xué)過程

2.1 課題引入

鄰苯二甲酸酯 (Phthalic Acid Esters，PAEs)是一類應(yīng)用廣泛的合成有機(jī)物。近年來，研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸酯類化合物極難降解，在體內(nèi)長期累積，嚴(yán)重干擾人類和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，具有致突變、致癌和致畸形的作用，因此，有關(guān)環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類污染物的控制和治理引起了人們的高度重視。其中6種被美國環(huán)境保護(hù)署列為優(yōu)先控制的環(huán)境污染物，我國環(huán)境保護(hù)部也將其中3種列為優(yōu)先控制的環(huán)境污染物，并發(fā)布了采用正相液相色譜法測定的標(biāo)準(zhǔn)[12]。

討論1:正相液相色譜法與反相液相色譜法各有什么特點(diǎn)?

小結(jié):在正相色譜法中，固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物。在反相色譜法中，固定相的極性小于流動(dòng)相的極性，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18H37(簡稱ODS或C18)、硅膠-苯基等，用極性溶劑為流動(dòng)相，如甲醇/水，乙腈/水，水和無機(jī)鹽的緩沖液等。水、甲醇、乙腈的穩(wěn)定性好，紫外吸收截止波長小、紫外吸收低、粘度低、互溶性好、混合溶劑的極性可以在很大范圍內(nèi)調(diào)整，應(yīng)用范圍比正相色譜法更廣泛，可以解決80%的液相色譜分析課題[13]。本實(shí)驗(yàn)將探索采用反相液相色譜測定鄰苯二甲酸酯類化合物的方法。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的設(shè)定和優(yōu)化

在色譜柱選定的前提下，需要設(shè)置的條件主要有柱溫、檢測器波長、流動(dòng)相組成、流動(dòng)相流量等。柱溫一般以略高于室溫為宜:30℃，流動(dòng)相流量一般為1.0 mL/min，MWD波長:228 nm。而流動(dòng)相組成對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響最大，一般應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)探索。

討論2:流動(dòng)相組成初始值應(yīng)如何設(shè)置?

小結(jié):初始試驗(yàn)點(diǎn)事先不知道的情況下，在選點(diǎn)方法、試驗(yàn)次數(shù)，黃金分割法具有最優(yōu)性[14]，這種方法能以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，迅速找到最優(yōu)方案，因而是一種常用的優(yōu)選法。根據(jù)“黃金分割法”優(yōu)選(即0.618法)，將流動(dòng)相中乙腈/水的組成初始值設(shè)為62/38。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

討論3:色譜分析方法的優(yōu)劣如何評價(jià)?

小結(jié):根據(jù)色譜圖可以大致判斷分析方法的優(yōu)劣:①分離度。譜峰數(shù)應(yīng)與組分?jǐn)?shù)相對應(yīng)，即樣品中有幾個(gè)組分就應(yīng)該有幾個(gè)峰，每個(gè)組分是否達(dá)到基線分離;②峰形。峰形尖銳、對稱(無前伸或拖尾)、大信噪比的窄峰最好，有利于提高定性、定量的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性;③分析速度。出峰時(shí)間的分布是否均勻，總體分析速度是否快。由圖1可見，分離度很好，但峰3較寬，出峰時(shí)間較慢、且與峰2相距較遠(yuǎn)，分析時(shí)間14 min左右，因此，需要進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 流動(dòng)相乙腈/水為62/38的色譜圖

討論4:色譜分析方法的優(yōu)化應(yīng)如何著手?

小結(jié):色譜分析方法的優(yōu)化，可以通過改變固定相、流動(dòng)相、溫度等條件來實(shí)現(xiàn)。在色譜柱選定的前提下，流動(dòng)相的組成與配比，是色譜系統(tǒng)分離性能的關(guān)鍵。優(yōu)化的目標(biāo)是在保證一定分離度的條件下，實(shí)現(xiàn)分析速度的最優(yōu)化，或在保證一定分析時(shí)間的條件下，實(shí)現(xiàn)難分離物質(zhì)對分離度的最優(yōu)化。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)增加流動(dòng)相淋洗強(qiáng)度，因?yàn)榉聪嘁合嗌V法的固定相為非極性，根據(jù)“相似相溶”原理，應(yīng)增加弱極性溶劑乙腈的含量，根據(jù)“黃金分割法”0.618+0.382 ×0.618=85，因此將流動(dòng)相乙腈/水的組成設(shè)為85/15。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 流動(dòng)相乙腈/水為85/15的色譜圖

由圖2可見，峰3的峰形得到了改善，分析時(shí)間縮短到7 min左右，但峰1、峰2的分離度變差，因此，需要進(jìn)一步優(yōu)化。

討論5:能否繼續(xù)改變乙腈/水組成的方法優(yōu)化?

小結(jié):當(dāng)樣品中所含組分的極性或其它性質(zhì)相差較大時(shí)，若采用等度洗脫，有時(shí)不能使所有的組分都得到較好的分離，或保留強(qiáng)的組分的出峰時(shí)間相差太遠(yuǎn)。這時(shí)可采用梯度洗脫的方法，即在分析過程中，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度比，從而使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子達(dá)到良好的分離，使保留強(qiáng)的組分在保證充分分離的前提下，盡快流出分離柱，縮短分析時(shí)間。

討論6:梯度洗脫的流動(dòng)相條件應(yīng)如何設(shè)置?

小結(jié):液相色譜梯度洗脫的比等度洗脫復(fù)雜得多，是色譜流動(dòng)相選擇性優(yōu)化的難點(diǎn)，要考慮梯度洗脫模式和梯度洗脫程序兩個(gè)問題。梯度洗脫模式分為線性梯度和非線性梯度，非線性梯度又分為曲線梯度、分段梯度、臺(tái)階梯度，其中線性梯度優(yōu)點(diǎn)是基線平滑，程序設(shè)計(jì)較簡單，是初試實(shí)驗(yàn)的首選。至于梯度洗脫程序的設(shè)計(jì)，可以借鑒以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對于峰1、峰2乙腈/水為62/38左右為宜，考慮到線性梯度過程中乙腈/水的比例是逐漸增大，因此，乙腈/水的組成初始值設(shè)為50/50，對于峰3乙腈/水應(yīng)大于85/15，因此，梯度洗脫程序設(shè)為0～8 min乙腈/水的組成從50/50變化到100/0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 梯度洗脫的色譜圖

從圖3可見，分析周期縮短，分離度高，所有峰形令人滿意。實(shí)驗(yàn)探索獲得成功。

討論7:梯度洗脫應(yīng)注意哪些問題?

小結(jié):梯度洗脫時(shí)，由于流動(dòng)相的混合、組成不斷變化，因此，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)注意以下問題:①為保證良好的重現(xiàn)性，梯度洗脫對儀器的性能要求更高;②對溶劑純度也有更高的要求，還要注意溶劑的互溶性，有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶，超出一定的范圍后就不會(huì)互溶。當(dāng)使用緩沖溶液時(shí)應(yīng)注意與有機(jī)溶劑混合時(shí)可能會(huì)析出鹽的結(jié)晶體;③ 連續(xù)使用時(shí)，每次進(jìn)樣梯度洗脫后，須增加對色譜柱進(jìn)行再生處理程序，使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)。

3 結(jié)語

由于現(xiàn)代分析儀器與計(jì)算機(jī)的聯(lián)用，智能化、自動(dòng)化程度越來越高，色譜工作站的功能越來越強(qiáng)大，但計(jì)算機(jī)畢竟是“機(jī)”，電腦永遠(yuǎn)不能代替人腦，色譜分析屬于多因素多目標(biāo)的體系，尋求優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件常常是建立色譜分析方法最困難的步驟，特別是液相色譜分析，可謂“法無定法”，沒有任何現(xiàn)成的方法可以照抄，任何色譜方法的建立和優(yōu)化，最終都得靠實(shí)驗(yàn)探索來完成。

設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的重要舉措，是提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能、實(shí)驗(yàn)素質(zhì)和創(chuàng)新能力的有效途徑[15]，教學(xué)和科研相結(jié)合，理論和應(yīng)用相結(jié)合，是促使一個(gè)優(yōu)秀實(shí)驗(yàn)形成的重要基礎(chǔ)[16]，教學(xué)中要堅(jiān)持以學(xué)生為本，注重創(chuàng)造師生之間的互動(dòng)氛圍，激發(fā)學(xué)生對實(shí)驗(yàn)的興趣，合理的安排時(shí)間，在有限的時(shí)間內(nèi)，增大信息量，充分發(fā)揮學(xué)生的主動(dòng)性和創(chuàng)造性，訓(xùn)練學(xué)生的科學(xué)思維方法，提高綜合分析和解決問題的能力。

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