袁微微，李新鳳，高俊明，王建明，郝曉娟，賀運春

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

鐮刀菌（Fusarium）是一類具有重要經(jīng)濟(jì)意義的真菌，廣泛分布于自然界中，兼性寄生或腐生生活。其中，多種鐮刀菌是重要的植物病原菌，由鐮孢菌侵染引起的瓜類枯萎病、瓜類根腐病等瓜類作物萎蔫病，都是經(jīng)土壤傳播的系統(tǒng)性病害，且均為生產(chǎn)上最難防治的病害。通常情況下，其在黃瓜、西瓜、冬瓜上發(fā)病最為嚴(yán)重，一般年份發(fā)病率為20%，嚴(yán)重的田塊可達(dá)80%～90%，是目前生產(chǎn)上制約瓜類作物生產(chǎn)的重要因素之一[1-2]。此外，一些弱致病鐮刀菌和非致病鐮刀菌還是植物的主要內(nèi)生菌，不僅能使寄主植物快速生長，增強(qiáng)植物的抗逆性，而且能產(chǎn)生豐富多樣的活性物質(zhì)，從而對病原細(xì)菌、真菌和線蟲產(chǎn)生拮抗作用，具有生物防治作用[3-10]?？梢?，鐮孢菌屬真菌對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作用重大。明確一個地區(qū)某種作物上鐮刀菌的種類，對于植物鐮刀菌病害的檢疫、防治和篩選拮抗作物病原菌的鐮刀菌都具有重要意義。

筆者于2010年4月至2011年8月在山西省各地區(qū)采集了具有萎蔫癥狀與健康的瓜類作物標(biāo)本共93份，進(jìn)行了鐮刀菌的分離、純化，并依據(jù)其形態(tài)特點與培養(yǎng)性狀進(jìn)行了初步鑒定，以期了解山西省瓜類作物上鐮刀菌的種類及分布特點，并有效防治其菌病害，提高瓜類作物產(chǎn)量及進(jìn)一步篩選具有生防作用的鐮刀菌資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 Armstrong液體培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，KCl 1.6 g，KH2PO41.1 g，Ca （NO3）25.9 g，F(xiàn)eSO4200 μg，MnSO4200 μg，ZnSO4200 μg，去離子水 1 000 mL。

1.1.2 康乃馨葉片培養(yǎng)基（CLA）[11]瓊脂20 g，水1 L，康乃馨葉片適量。將3～5 mm2大小的無菌康乃馨葉片放入冷卻到45℃的滅菌水瓊脂平板表面（一般情況下，直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)加入10～12塊即可）。接種時，菌塊要靠近康乃馨葉片。

1.1.3 Spezieller N?hrstoffarmer瓊脂培養(yǎng)基（SNA）

KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KNO31 g，KH2PO41 g，蔗糖 0.2 g，葡萄糖 0.2 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 L。將滅菌培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中制成平板，待平板冷卻后，在其表面放入1～2片濾紙條[12]。

1.1.4 2%水瓊脂培養(yǎng)基（WA） 瓊脂20 g，自來水1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本采集 樣本采集的時間和地點如表1所示。采集的樣本種類主要為黃瓜、西瓜、西葫蘆等瓜類作物的根莖組織。

表1 供試菌株及來源

1.2.2 鐮刀菌的分離與純化 采用常規(guī)組織分離法，對采集到的樣本的根莖部鐮刀菌進(jìn)行分離、純化。將供試材料用無菌刀片切成小塊（0.5 cm2），置于70%酒精中浸泡幾秒鐘，取出后用無菌水沖洗干凈，并用滅菌濾紙吸干表面的水分，然后置于2%的水瓊脂平板表面，每平板4～5塊，之后置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。待長出菌落后，用稀釋平板法進(jìn)行單孢分離。然后利用形態(tài)學(xué)分類方法對單孢分離物進(jìn)行初步鑒定、編號，并記錄不同種鐮刀菌的分離頻率。培養(yǎng)過程中，為避免細(xì)菌污染，可在培養(yǎng)基中加入適量抗菌素（如氯霉素、鏈霉素等），一般在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至45℃左右時加入。

挑取菌體置于顯微鏡下鏡檢，將明顯混雜其他雜菌的鐮刀菌菌落要先接入平板，經(jīng)數(shù)次純化后進(jìn)行單孢分離；如果經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)菌落沒有污染其他雜菌，則可直接進(jìn)行單孢分離。

1.2.3 鐮刀菌的培養(yǎng)及形態(tài)觀察 參考文獻(xiàn)[13]的方法，將單孢分離后的培養(yǎng)物接種到CLA，SNA，PDA，WA培養(yǎng)基上適當(dāng)培養(yǎng)，進(jìn)行培養(yǎng)性狀及顯微形態(tài)觀察，用于該鐮孢菌種的鑒定。培養(yǎng)性狀主要包括菌落在PDA培養(yǎng)基上的質(zhì)地、顏色以及基質(zhì)顏色和菌體生長速率。顯微形態(tài)包括大、小型分生孢子及厚垣孢子、子實體的形態(tài)，產(chǎn)孢細(xì)胞、產(chǎn)孢梗的形態(tài)及形成方式等。

1.2.4 鐮刀菌的鑒定 參考Leslie等[12，14-15]的分類系統(tǒng)，對分離到的鐮刀菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品分離、純化結(jié)果

從山西省采集的93份瓜類作物樣品中，共分離到353株鐮刀菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，其分屬于8種鐮刀菌（表2），分別是尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、芬芳鐮刀菌（F.redolens）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、輪枝鐮刀菌（F.verticillioides）、層生鐮刀菌（F.proliferatum）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）半裸鐮刀菌（F.semitectum）、銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）。其中，尖孢鐮刀菌225株，占鐮刀菌總量的65.03%，為優(yōu)勢菌群；其次是腐皮鐮刀菌，共分離到60株，占總量的17.34%；芬芳鐮刀菌和銳頂鐮刀菌較少，分別只有2，3株。

表2 鐮刀菌分離結(jié)果

2.2 鐮刀菌形態(tài)特點

2.2.1 尖孢鐮刀菌 由圖1可知，菌落表面常見菌絲扭結(jié)成束后凌亂地編織成類似網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)，菌落生長速度較快；PDA上25℃培養(yǎng)4 d，菌落直徑為4.9～5.2 cm；氣生菌絲羊毛狀，白色、淡青蓮至淡粉色；基物表面茄皮紫，基物不變色。由氣生菌絲上側(cè)生產(chǎn)孢細(xì)胞，在有稀疏分枝或無分枝的分生孢子梗上形成單瓶梗，產(chǎn)孢細(xì)胞安瓿瓶形、較短、領(lǐng)口明顯。產(chǎn)生大量假頭生的小型分生孢子，橢圓形、卵形或腎形，0～1個分隔，量度為（4.8～10.1）μm×（2.0～4.6）μm。易產(chǎn)生桔黃色黏孢團(tuán)型分生孢子座。大型分生孢子美麗型，孢子較細(xì)、較彎曲，向兩端比較均勻地逐漸變尖，足跟明顯。細(xì)胞壁薄，2～6個分隔，多為3～5個分隔，量度為（20.2～36.6）μm×（3.3～4.5）μm。厚垣孢子球形，表面光滑，單生、雙生或聚生于菌絲間。

2.2.2 芬芳鐮刀菌 由圖2可知，菌落蛛網(wǎng)狀，PDA上25℃培養(yǎng)4 d，菌落直徑為4.1～4.6 cm。

其氣生菌絲羊毛狀或氈狀，蒼白、米色至淡青蓮色；基物表面青蓮色，基物不變色。自氣生菌絲上側(cè)生或在短的分枝上形成瓶狀小梗，單瓶梗，產(chǎn)孢梗長度介于尖孢鐮刀菌與腐皮鐮刀菌之間，分枝少。小型分生孢子數(shù)量多，假頭生，橢圓形，卵形或腎形，0～1個分隔，量度為（6.72～18.34）μm×（2.30～4.13）μm。大型分生孢子介于美麗型與馬特型之間，比尖孢鐮刀菌稍寬，頂胞稍鈍，基胞足跟不明顯，分隔不清楚，量度為（31.2～46.2）μm×（3.7～6.3）μm。厚垣孢子球形，表面光滑，單個頂生或串生。

2.2.3 腐皮鐮刀菌 由圖3可知，PDA上25℃培養(yǎng)4 d，菌落直徑為2.8～4.9 cm。氣生菌絲羊絨狀，白色至淺灰色，大多數(shù)菌株呈奶油色，中央有土黃色黏孢團(tuán)，少數(shù)菌株菌落背面可產(chǎn)生藍(lán)紫色色素；基物表面肉色，基物不變色。前期在氣生菌絲上長出的產(chǎn)孢細(xì)胞為菌絲形的單瓶梗，產(chǎn)孢梗長，大于 50 μm，長可達(dá)到 200 μm，在成熟培養(yǎng)物上形成分生孢子座，其上可成簇產(chǎn)生短而多分枝的產(chǎn)孢梗，頂端領(lǐng)口明顯。大型分生孢子馬特型，即大型分生孢子最寬處在孢子中線上部，兩端較鈍，頂細(xì)胞稍彎；基細(xì)胞鈍圓形或足跟不明顯，整個孢子形態(tài)較短、較胖，2～7個分隔，多數(shù) 3～5個分隔，量度為（23.7～37.7）μm×（3.7～6.4）μm。有大孢子融合現(xiàn)象。在幼培養(yǎng)中會產(chǎn)生大量假頭生小型分生孢子，橢圓形、卵形或腎形，比較寬，0～1個分隔，多為1個分隔，量度為（7.6～17.7）μm×（2.1～5.4）μm，明顯比其他種類鐮刀菌的小型分生孢子粗胖。

2.2.4 輪枝鐮刀菌 由圖4可知，氣生菌絲羊毛狀至粉狀，粉色至紫色，后產(chǎn)生深紫色色素，基物表面及基物為暗紫色。在PDA平板上25℃培養(yǎng)4 d后，菌落直徑為35～46 mm。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，瓶形，分枝或不分枝。小型分生孢子多，呈鏈狀，分生孢子鏈較長，一般都大于50 μm，有時聚集形成假頭狀。小孢子一端平截，為典型的棒槌形，沒有或有1個分隔，量度為（4.1～8.2）μm×（1.7～3.9）μm。菌體培養(yǎng)后期可產(chǎn)生桔黃色分生孢子座。大型分生孢子細(xì)長、較直，孢子的背腹兩側(cè)近似平行，兩端微收縮。頂細(xì)胞為漸細(xì)的錐形，略彎曲，基細(xì)胞為不明顯的足跟狀，大孢子壁較薄，分隔明顯，一般為3～5個分隔，量度為（24.3～41.4）μm×（3.7～4.9）μm。

2.2.5 層生鐮刀菌 由圖5可知，菌落蛛網(wǎng)狀，生長速度中等，PDA上25℃培養(yǎng)4 d后，菌落直徑為4.7～4.9 cm。氣生菌絲羊毛狀，菌落初期白色或淡紫色，基物紫色。氣生菌絲上有分枝較多的產(chǎn)孢梗，單瓶?；驈?fù)瓶梗（層出梗），產(chǎn)孢細(xì)胞瓶形。常見較長的產(chǎn)孢細(xì)胞旁邊有一個很短的產(chǎn)孢點，或形成Z字形，層生的復(fù)瓶梗，為典型的層出復(fù)瓶梗。小型分生孢子串生或假頭生，卵形、橢圓形或棒槌形，通常無分隔，量度為（6.9～19.9）μm×（2.3～4.7）μm。在氣生菌絲的產(chǎn)孢細(xì)胞上形成大量較長的分生孢子鏈。有些菌株培養(yǎng)后期可產(chǎn)生桔黃色分生孢子座。大型分生孢子鐮刀形，較直而細(xì)長，細(xì)胞壁薄，且通常不易產(chǎn)生，頂細(xì)胞尖而彎曲，足細(xì)胞明顯，3～5個分隔，量度為（27.3～49.2）μm×（3.3～4.6）μm。缺乏厚垣孢子。

2.2.6 禾谷鐮刀菌 由圖6可知，在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落生長初期呈放射狀。氣生菌絲呈羊毛狀旺盛生長，白色至紫紅色，菌落中央常呈淺駝色至黃褐色，菌落背面為紫紅色。在25℃下培養(yǎng)4 d后，菌落直徑為2.6～3.3 cm。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，小型分生孢子缺乏。在SNA或CLA上產(chǎn)生桔黃色分生孢子座。大型分生孢子較直或鐮刀形，頂細(xì)胞略彎曲、漸尖，短喙?fàn)?，基部足跟明顯，一般3～6個分隔，多為5個分隔，量度為（39.13～78.73）μm×（3.99～6.37）μm。在培養(yǎng)后期大孢子數(shù)量明顯減少。厚垣孢子聚生或串生，間生或頂生，球形或近球形，淺褐色。

2.2.7 半裸鐮刀菌 由圖7可知，在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)4 d后，菌落直徑為4.2～5.6 cm。氣生菌絲羊毛狀或羊絨狀，初期白色至淡粉紅，菌落背面粉色，后期菌落變?yōu)闇\駝色至褐色，基物表面茶褐色，菌落背面深褐色。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗、復(fù)瓶梗和多芽產(chǎn)孢共存。氣生菌絲上產(chǎn)生的大、小孢子間沒有明顯界限，存在大量的中型分生孢子。分生孢子多數(shù)為倒卵形或紡錘形，稍彎或直。分生孢子座上產(chǎn)生的孢子鐮狀、稍彎，頂細(xì)胞楔形，基細(xì)胞突起，足跟有或無，多為3～5個分隔，量度為（28.72～39.99）μm×（4.61～5.93）μm。厚垣孢子極少，球形，單頂生或串生于菌絲中間，褐色。

2.2.8 銳頂鐮刀菌 由圖8可知，在PDA上培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)4d后，菌落直徑為4.4～5.0cm。氣生菌絲棉絮狀，淡粉紅至淡豆沙色，有橙色黏孢團(tuán)?；锉砻娌韬稚锊蛔兩?。通常為單瓶梗產(chǎn)孢，小型分生孢子少，錐形或鐮狀。橙色黏孢團(tuán)上上易形成分生孢子座。大孢子整齊典型，鐮刀形，腹背明顯彎曲，頂胞呈銳角、細(xì)長。基胞足跟明顯，有2～4個分隔，多為3個分隔，量度為（19.7～36.6）μm×（2.7～4.7）μm。厚垣孢子球形，表面不光滑，單頂生或串生于菌絲。

3 結(jié)論與討論

通過對山西省黃瓜、西瓜、西葫蘆等瓜類作物上鐮刀菌的分離、純化、鑒定，初步明確了山西省瓜類作物根莖部鐮刀菌有8種，分別為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、芬芳鐮刀菌（F.redolens）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、輪枝鐮刀菌（F.verticillioides）、層生鐮刀菌（F.proliferatum）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）半裸鐮刀菌（F.semitectum）、銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）。其中，尖孢鐮刀菌為優(yōu)勢菌群，其次是腐皮鐮刀菌。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究山西省瓜類作物鐮刀菌病害、鐮刀菌的生物防治等方面奠定了理論基礎(chǔ)。

寄生于植物體內(nèi)的鐮刀菌，多數(shù)為植物病原菌，如瓜類枯萎病是由寄生于瓜類作物的尖孢鐮刀菌引起，腐皮鐮刀菌是引起瓜類作物根腐病的主要病原菌。本研究所選材料有些為健康植株，而有些則是具有萎蔫癥狀的病株，鑒定結(jié)果表明，尖孢鐮刀菌為優(yōu)勢菌群，腐皮鐮孢菌也較其他菌種多，所以可以確定本試驗分離到的這2種鐮刀菌中部分菌株為致病菌。此外，在枯萎病和根腐病的病株中，還分離到與報道的病原菌不同的其他菌株。如西葫蘆根腐病病株中除分離到腐皮鐮刀菌外，還分離到半裸鐮刀菌；西瓜枯萎病病株中除分離到尖孢鐮刀菌還分離到禾谷鐮刀菌，但半裸鐮刀菌和禾谷鐮刀菌對于這2種病害的作用及其與寄主植物的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

植物內(nèi)生真菌與寄主植物關(guān)系復(fù)雜，研究表明,許多內(nèi)生鐮刀菌中的非致病性菌株和弱毒菌株對作物的微管束病害具有交叉保護(hù)和誘導(dǎo)抗性作用。據(jù)文獻(xiàn)報道，有些可用來防治甘藍(lán)、番茄、黃瓜、西瓜、甘薯等作物的枯萎病[5，7-8]，有些則用來控制植物寄生線蟲[16-17]。本研究中，部分菌株分離自枯萎病或根腐病嚴(yán)重發(fā)生地塊的健康植株，這為進(jìn)一步從這些菌株中開發(fā)對枯萎病或根腐病等根部病害具有生防作用的菌株奠定了基礎(chǔ)。

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