口腔鱗癌Th1／Th2平衡漂移中IL-4、IL-10、TGF-β表達(dá)與腫瘤發(fā)展關(guān)系探討

申葉春，曹 巖，張 凡

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000；2.河北省張家口市第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，河北 張家口 075000）

腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞相互作用促使腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的表型和特性發(fā)生改變，使T細(xì)胞免疫過程中出現(xiàn)Th1／Th2平衡向Th2漂移，Th1細(xì)胞因子分泌收到抑制，同時(shí)Th2細(xì)胞因子分泌增加，導(dǎo)致腫瘤組織處于深度的免疫抑制狀態(tài)，便于腫瘤細(xì)胞通過分泌多種細(xì)胞因子，使腫瘤細(xì)胞外形、微環(huán)境和免疫表型改變，使其更加適宜浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。IL-4、IL-10是腫瘤組織中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 （tumor infiltrating lymphocytes，TIL）分泌的關(guān)鍵因子，在TIL－IL-4－IL-10導(dǎo)致的腫瘤免疫抑制惡性循環(huán)中發(fā)揮重要作用，而TGF－β在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換以及促進(jìn)腫瘤血管新生等方面發(fā)揮積極作用，但是口腔鱗癌中相關(guān)的研究目前少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化探討口腔鱗癌組織內(nèi)三者在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中的陽性分布規(guī)律以及與口腔鱗癌發(fā)展的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

1997-01—2007-01月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除或活檢標(biāo)本鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本49例。取材部位：舌12例，牙齦12例，口底25例。其中高分化鱗狀細(xì)胞癌20例，中分化鱗狀細(xì)胞癌15例，低分化鱗狀細(xì)胞癌14例；腫瘤體積小于3cm 26例，大于3cm 23例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；Ⅰ、Ⅱ期25例，Ⅲ、Ⅳ期24例；浸潤(rùn)?quán)徑K器27例，無鄰近臟器浸潤(rùn)22例；存在脈管內(nèi)癌栓20例，無脈管內(nèi)癌栓29例，以上結(jié)果再次經(jīng)資深病理醫(yī)師確認(rèn)證實(shí)。

1.2 免疫組織化學(xué)試劑及主要染色步驟

IL-4、IL-10、TGF-β鼠抗人單克隆抗體均購(gòu)于福建邁新生物技術(shù)有限公司。采用常規(guī)S-P法，各步驟間嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度，每次染色均以公司提供的陽性切片設(shè)置陽性對(duì)照，同時(shí)利用PBS代替單克隆一抗作為陰性對(duì)照。

主要免疫組化步驟：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化酶，PBS緩沖液振洗，微波爐進(jìn)行抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗、三抗各1h，DAB顯色10～15min，復(fù)染核脫水透明，中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判斷及圖像軟件分析

著色細(xì)胞＜10%為陰性，＞10%為陽性。IL-4、IL-10、TGF-β陽性物質(zhì)均定位在腫瘤細(xì)胞以及間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞漿。采用HIPAS100圖象分析軟件對(duì)所有切片進(jìn)行圖象分析，首先低倍鏡尋找每張切片著色的典型區(qū)域，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)著色典型區(qū)域且不重復(fù)的視場(chǎng)，放大400倍鏡下測(cè)量每個(gè)視場(chǎng)中陽性灰度單位，取其均數(shù)即為該切片的著色強(qiáng)度 （即灰度單位）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，IL-4、IL-10、TGF-β表達(dá)水平與腫瘤臨床病例參數(shù)間的血管分析采用t檢驗(yàn)，各指標(biāo)表達(dá)水平的關(guān)系采用直線回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤組織IL-4、IL-10、TGF-β陽性細(xì)胞的分布特點(diǎn)及染色情況

腫瘤細(xì)胞及部分間質(zhì)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-4、IL-10、TGF-β，三種指標(biāo)在腫瘤組織中的陽性表達(dá)有差異，中央?yún)^(qū)陽性細(xì)胞較多，呈現(xiàn)高水平表達(dá)，腫瘤浸潤(rùn)前沿內(nèi)陽性細(xì)胞較少，表達(dá)水平明顯降低，兩區(qū)域指標(biāo)的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。

2.2 腫瘤組織IL-4、IL-10、TGF-β陽性表達(dá)水平與口腔鱗癌病理參數(shù)關(guān)系

IL-4在口腔鱗癌的高分化組、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、無脈管內(nèi)癌栓組表達(dá)明顯低于相應(yīng)中低分化組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和存在脈管內(nèi)癌栓組，同時(shí)其表達(dá)水平與細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓密切相關(guān)（P＜0.05）；IL-10在口腔鱗癌Ⅰ、Ⅱ期無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯低于相應(yīng)Ⅲ、Ⅳ期和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，其表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）；TGF-β在口腔鱗癌的體積較小組、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、無脈管內(nèi)癌栓組表達(dá)明顯低于體積較大組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組以及存在脈管內(nèi)癌栓組，其表達(dá)水平與口腔鱗癌的體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓密切相關(guān) （P＜0.05），見表1。

表1 IL-4、IL-10、TGF-β在口腔鱗癌的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 IL-4、IL-10、TGF-β表達(dá)在腫瘤不同區(qū)域的血管分析分析

腫瘤中央?yún)^(qū)IL-4、IL-10、TGF-β表達(dá)水平之間兩兩密切相關(guān)（IL-4、IL-10間r＝0.661 7，P＜0.05；IL-10、TGF-β間r＝0.886 2，P＜0.05；IL-4、TGF-β間r＝0.573 1，P＜0.05），腫瘤浸潤(rùn)前沿組織中IL-4、IL-10表達(dá)存在明顯相關(guān) （r＝0.752 9，P＜0.05）。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞共同構(gòu)成其生存的微環(huán)境，細(xì)胞間的相互作用伴隨腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)間質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用與免疫逃逸密切相關(guān)，腫瘤的免疫逃逸可能存在以下機(jī)制：腫瘤細(xì)胞表面組織相容性抗原以及共刺激分子表達(dá)下降；腫瘤細(xì)胞表面抗原的突變或缺失；腫瘤細(xì)胞表面受體信號(hào)分子的改變；免疫抑制性細(xì)胞因子的生成 （VEGF、IL-10、PGF-2、IL-6、TGF-β）；T細(xì)胞功能缺陷，大量免疫抑制性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成；抗原遞呈細(xì)胞分化成熟、遷移異常，功能缺陷［1－4］?？谇击[癌患者極易出現(xiàn)局部浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，具體的機(jī)制尚不清晰，而新近研究提示免疫逃逸在腫瘤局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞都可以分泌TGF－β，其進(jìn)入細(xì)胞將內(nèi)與SMADs結(jié)合，將信號(hào)傳導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)，增加細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶的抑制蛋白 （P15、P21、P27）的合成，使細(xì)胞停滯在G1期內(nèi)，同時(shí)通過抑制c-myc抑制T細(xì)胞的增殖。肝臟是TGF的主要靶器官之一，小鼠四氯化碳酒精注射誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌，經(jīng)門靜脈灌注反義SMAD4cDNA后纖維化程度下降，腫瘤直徑及數(shù)目減少，促進(jìn)部分原癌基因的表達(dá)，抑制γ－干擾素的合成，抑制IL-18、IL-2受體表達(dá)，拮抗IFN－γ、IL-1的免疫反應(yīng)［5－6］。同時(shí)促進(jìn)Th2細(xì)胞過度產(chǎn)生IL-10和IL-4，從而抑制Th1類細(xì)胞因子的合成，下調(diào)MHC－Ⅱ類分子的表達(dá)，促進(jìn)Th1／Th2平衡向Th2漂移，這樣形成Th2細(xì)胞因子的強(qiáng)勢(shì)分泌，機(jī)體抗腫瘤免疫處于抑制狀態(tài)［7］。我們的實(shí)驗(yàn)顯示TGF－β在口腔鱗癌的體積較小組、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、無脈管內(nèi)癌栓組表達(dá)明顯低于體積較大組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組以及存在脈管內(nèi)癌栓組，其表達(dá)水平與口腔鱗癌的體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓密切相關(guān)。腫瘤中央?yún)^(qū)IL-4、IL-10、TGF-β表達(dá)水平之間兩兩密切相關(guān)。陽性細(xì)胞在口腔鱗癌中中央?yún)^(qū)的表達(dá)升高，說明TGF－β通過干預(yù)口腔鱗癌的免疫機(jī)制導(dǎo)致腫瘤免疫狀態(tài)下降，便利其局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移；同時(shí)TGF－β在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程以及血管新生等方面對(duì)腫瘤細(xì)胞都具有促進(jìn)作用，增加了局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的能力。

IL-4來源于腫瘤細(xì)胞、浸潤(rùn)的CD8陽性的T細(xì)胞，可抑制Th1介導(dǎo)Th2型細(xì)胞發(fā)育，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-10啟動(dòng)因子，IL-10有可促進(jìn)形成新的Th2性腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，后者再促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生，從而形成TIL－IL-4－IL-10的惡性循環(huán)，是機(jī)體陷入深度的腫瘤免疫抑制狀態(tài)。IL-10在早期腫瘤中有腫瘤細(xì)胞、浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，晚期則由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，正常機(jī)體的抗腫瘤免疫作用應(yīng)以Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答為主，但大多數(shù)腫瘤患者體內(nèi)產(chǎn)生Th1／Th2漂移，表現(xiàn)為Th2細(xì)胞因子合成占優(yōu)勢(shì)［8－9］。IL-10可抑制Th1類細(xì)胞因子的合成，阻抑抗原呈遞細(xì)胞在腫瘤組織的浸潤(rùn)，分化成熟和對(duì)抗原的趨化反應(yīng)，誘導(dǎo)其表面HLA-1Ⅱ類分子CD68、CD86、CD40低表達(dá)或不表達(dá)。此外腫瘤細(xì)胞分泌的TGF能顯著促進(jìn)IL-10的分泌［10－12］。IL-4在口腔鱗癌的高分化組、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、無脈管內(nèi)癌栓組表達(dá)明顯低于相應(yīng)中低分化組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和存在脈管內(nèi)癌栓組，同時(shí)其表達(dá)水平與細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓密切相關(guān) （P＜0.05）。IL-10在口腔鱗癌的Ⅰ、Ⅱ期無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯低于相應(yīng)Ⅲ、Ⅳ期和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；其表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān) （P＜0.05）。腫瘤中央?yún)^(qū)IL-4、IL-10、TGF-β表達(dá)水平之間兩兩密切相關(guān)。說明口腔鱗癌組織中存在TIL-IL4-IL10的惡性循環(huán)，導(dǎo)致Th1／Th2漂移產(chǎn)生，表現(xiàn)為Th2細(xì)胞因子高度分泌，使機(jī)體的免疫功能受到抑制，出現(xiàn)局部的浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。盡管腫瘤間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，但是其免疫功能出現(xiàn)異常，抗原呈遞能力下降，無法清除腫瘤細(xì)胞，相反其分泌的細(xì)胞因子便利腫瘤細(xì)胞變形、遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

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