楊 升，賈東平，劉家慧

（1.天津農學院，天津 300384；2.青島濱海學院，山東 青島 266555）

自1956年Polge首次利用冷凍精液人工授精獲得仔豬至今，豬精液冷凍技術雖然經過多年的發(fā)展，但與奶牛冷凍精液的應用相比，仍有很大差距。早在1930年，Milovanov等對豬人工授精進行了試驗，并提出最初的豬精液稀釋劑(葡萄糖-硫酸鹽和葡萄糖-酒石酸鹽)。近年來豬精液冷凍保存液中非滲透性保護劑糖類物質的加入引起了研究人員的高度關注，糖類在生物活性細胞脫水的情況下在細胞膜外形成一層保護膜，從而在冷凍過程中保護細胞膜的完整性，最終達到保護精子的作用。

1 材料與設備

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

天津某種豬場提供的1.5～2歲、體格健壯、性欲旺盛的8頭約克夏種公豬。

1.1.2 試驗藥品

Hepes (H-3375)，Hoechst33342(H33342 ；B-2261)， Propidium Iodide(PI; P-4170)，F(xiàn)luorescein-labeled lectin from Arachis hypogaea(FITC-PNA; L-7381)， Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO；D-2650)和 Bovine Serum Albumin (BSA；A-4503)等及一些常用試驗藥品如葡萄糖；檸檬酸；檸檬酸鈉等均購自 Sigma化學公司（St. Louis, MO，美國），Mito Tracker? Orange CMTMRos(MITO, M-7510)，Yo-Pro-1 (Y-3603)和 erocyanine 540(M24571)購自分子探針公司（Eugene, OR，美國），其他試劑為國產分析純均為市售藥品。

1.1.3 液體的配制

ZO液： 葡 萄 糖1.15 g，EDTA 0.23 g，檸檬酸鈉1.17 g，碳酸氫鈉0.125 g，Tris 0.65 g， 檸 檬 酸 0.41 g，半膚胺0.01 g，BSA 0.5 g；

冷凍液I：葡萄糖1.5 g，乳糖3.0 g，甘氨酸8 g，卵黃24 mL/l00 mL；

冷凍液II：在I液中加入6%甘油。

1.2 設備

高速離心機 Eppendorf centrifuge 5810R，德國

水浴鍋 W20M-2E，美國

超純水儀 Millpore，法國

高壓滅菌鍋 HV-110，日本

超凈工作臺 ESCO，新加坡

精子貯藏冰箱 Hisense BC-50，中國北京

移液器 EPPENDORF，德國

熒光正置顯微鏡 Nikon ECLIPSE 50i，日本

偉力彩色精子質量檢測系統(tǒng)（CASA）WLJY-9000，中國北京

2 試驗方法

2.1 精液的采集

精液采集采用手握法，采精后選擇中段精液，經4層消毒紗布過濾去除膠狀物，收集精子富集部分。精液采集后立即用顯微鏡進行常規(guī)品質檢查，精子活率在0.7以上、色澤為乳白色的精液，在35～37 ℃于1 h內運抵實驗室備用。

2.2 精液稀釋與冷凍

在室溫條件下，過濾后的精液先用常溫保存液ZO液按照（V/V)稀釋，避光靜置1 h后以2 400 g離心3 min去上清再添加冷凍稀釋I液，于5 ℃平衡1 h再添加等量的稀釋II液，使甘油的工作濃度為3%，繼續(xù)在5 ℃平衡1～3 h裝入0.25 mL細管，用聚乙烯醇粉末封口，單層放置液氮面上3 cm平衡10 min后直接投入液氮保存，凍精解凍時，從液氮中取出細管，迅速投入37 ℃水浴30 s，然后稀釋至2 mL解凍液中，室溫放置10 min待檢。

2.3 凍精質量評定

2.3.1 精子活力

移液槍取10 μL精液于載玻片上，置于37 ℃恒溫載物臺上，在400×顯微鏡下評定精子活力（直線前進），每個片子至少檢查200個精子。

2.3.2 質膜完整性

將解凍后的精液用果糖-檸檬酸鈉低滲液稀釋，調整精子密度為 1×106～ 2×106/mL，37 ℃ 孵 育30 min后，取20 μL精子懸液于血細胞計數(shù)板上，400×倒置顯微鏡下觀察不同部位5個視野，每次至少數(shù)200個精子，計算彎尾精子的百分率。

2.3.3 頂體完整性

將解凍后的精液滴到含3%等溫PVP液的離心管內，800×g離心6 min，棄上清液；沉淀精子用37 ℃的PBS溶液重懸，調整精子密度為(1～2)×106/mL。移液槍吸取30 μL精子懸液，涂片，空氣中自然干燥后，用純甲醇固定10 min，再加入30 μL FITC-PNA染液，37 ℃、黑暗潮濕環(huán)境下孵育30 min。之后再用PBS溶液沖洗，空氣中自然干燥后加少許增光劑混勻，蓋上蓋玻片，盡快用400×熒光顯微鏡觀察。每次檢測時，每個片子計數(shù)200個精子。

2.3.4 精子獲能

首 先 在50 μL精 液 中 加 入500 μLHepes緩沖液，以 500 g離心5 min，棄掉上清，用 20 μL Hepes緩沖液重懸沉淀。染色時，將處理的精液加入100 μL添加有0.025 μL H33342、2 μLMerocyanine540 和 2 μLYo-Pro-1基礎液的Hepes緩沖液中，混勻后在37 ℃水浴中避光平衡20 min；然后用同樣的方法對染色后的精液進行離心洗滌。最后取5 μL處理后的精液于載玻片，用上述方法對精子的獲能狀況進行檢測。其中，非膜滲透性的核酸熒光染料Yo-Pro-1，標記細胞膜受損的和去穩(wěn)定的精子細胞核，呈現(xiàn)綠色熒光；M540 使有活力的精子（未被 Yo-Pro-1 染色）呈現(xiàn)2種類型的熒光，熒光弱的表示精子未獲能，而熒光強的表示精子獲能。

3 試驗方案

1）以ZO液為基礎液，進行前期的處理，對照組使用冷凍液I和II進行冷凍，試驗組用水蘇糖代替冷凍液I中的葡萄糖和乳糖，并調節(jié)水蘇糖的劑量進行最適劑量的選擇。

2）以前一步篩選的水蘇糖的劑量進行試驗，觀察水蘇糖在精子冷凍過程中對精子生理參數(shù)的影響。

4 統(tǒng)計分析

通過SPSS統(tǒng)計軟件，利用t檢驗和方差分析進行數(shù)據(jù)處理。

5 結果與分析

5.1 添加水蘇糖濃度的篩選

精液解凍后，用不同熒光染色劑進行特異性染色，根據(jù)激發(fā)熒光不同利用熒光顯微鏡分別評定，結果見表1。

從表1可以看出，不同添加劑量的水蘇糖對精子凍后活力具有很大影響，水蘇糖在稀釋液中的最佳添加量為4.5 g，此時對精子的保護作用最強，精子凍后效果最佳。隨著水蘇糖添加比例的增減對精子的保護效果不同，其適宜的添加量為4.5 g。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)顯示，在此冷凍配方中可以用水蘇糖代替葡萄糖和乳糖，其冷凍效果比原來配方的冷凍效果好。

表1 不同濃度水蘇糖對解凍精子活力的影響

5.2 添加水蘇糖對解凍后精子質膜的影響

從表2可知，在4.5 g的添加量時水蘇糖在冷凍-解凍過程中對豬精子起到較好的保護作用，水蘇糖顯著提高凍后精子的頂體完整性，頂體完整率最高達到69.4%。而隨著添加比例的增加，精子的頂體完整率逐漸提高，各濃度水平間差異顯著。

表2 不同添加濃度水蘇糖對豬凍精質膜完整性的影響

5.3 添加水蘇糖對解凍后精子頂體完整性的影響

精子頂體覆蓋了精子頭部的80%，含有能穿透卵細胞外卵丘和透明帶的酶，如果受到損傷，精子就會失去使卵子受精的能力。同樣，如果精子質膜受到損傷或者發(fā)生變化，直接導致精子活力和受精能力下降。從表3可知，在4.5 g的添加量時水蘇糖在冷凍-解凍過程中對豬精子起到較好的保護作用。

表3 水蘇糖對解凍后精子頂體完整性的影響

5.4 添加水蘇糖對解凍后精子獲能的影響

在冷凍-解凍過程中，精子的獲能狀態(tài)可主要由Ca2+濃度及其分布確切反映。水蘇糖可以進入細胞內的高濃度Ca2+區(qū)間，且與Ca2+結合，而水蘇糖-Ca2+復合物容易與細胞膜內的疏水區(qū)結合，在熒光顯微鏡下根據(jù)激發(fā)熒光的強度和分布，反映獲能過程中精子各時期Ca2+短暫的變化和分布規(guī)律，從而分析精子頂體完整狀態(tài)。不同添加比例對水蘇糖獲能處理前后精子的獲能情況的影響見表4。

表4 水蘇糖對解凍后精子獲能的影響

從表4可見，在獲能處理前，與對照組相比，水蘇糖可以明顯地降低冷凍-解凍過程中精子的獲能百分率，在4.5 g的添加比例時精子獲能率僅3.68%。從獲能處理后精子的獲能情況分析，添加水蘇糖可以顯著提高凍后精子的獲能潛力，其最佳添加量為4.5 g，獲能精子的百分率為28.6%，隨著體外觀察時間的延長，精子的獲能也有所增加。

6 討論與結論

從本研究可以看出，稀釋液中添加25%的水蘇糖可以明顯提高冷凍-解凍后精子的活率、活力、線粒體活性和質膜完整性等。隨著水蘇糖添加比例的增加，精子的頂體完整率越高，說明水蘇糖可以有效保護冷凍-解凍過程中精子頂體的完整性，與Bayarad等在山羊精子冷凍保存的研究結果一致[1]；在保護精子質膜方面，也與本研究結論一致[1]。但是，關于對凍后水蘇糖精子活率的影響與Aboagla等在山羊和Woelders等在牛精子冷凍方面的研究結論不同[2-3]，這可能是由于不同種家畜其精子對不同稀釋液滲透壓的耐受能力不同，豬精子對高滲溶液的耐受性較山羊精子和牛精子差，滲透壓的升高導致精子迅速脫水死亡的緣故。水蘇糖是一種穩(wěn)定的非還原性雙糖，對生物體或生物大分子具有獨特的非特異性保護作用，研究發(fā)現(xiàn)，水蘇糖作為一種水分替代分子，冷凍過程中避免了細胞膜在固相-液相轉變中受傷害，在細胞內主要作為一種親和性溶質來抗衡胞外的滲透壓變化。關于水蘇糖保護細胞的分子理，不同學者提出不同學說，但眾多研究表明，水蘇糖的保護機制與其晶體結構、溶液的物理構和化學特性密切相關[4-5]。在精子冷凍時，水蘇糖可強有力地束縛水分子，與膜脂質共同擁有結合水者本身起到代替膜結合水的功用，保持細胞內濕潤，防止細胞因失水而造成養(yǎng)分的損失和細胞的損傷，具有穩(wěn)定細胞膜和蛋白質結構的特性。

[1]Bayarad M N, et al.The effect of antioxidants on post-thawed Angora goat (Capra hircus ancryrensis)sperm parameters, lipid peroxidation and antioxidant activities[J].Small Ruminant Research,201089(1):24-30.

[2]Woelders, D. and M. Kurpisz,Reactive oxygen species and sperm cells [J]. Reprod Biol Endocrinol,2004，2(12):1-7.

[3]Aboagla, S.G., H2O2, a necessary evil for cell signaling [J]. Science,2006, 312(5782): 1882-1883.

[4]Bansal,A.K.and G.S.Bilaspuri,Impacts of Oxidative Stress and Antioxidants on Semen Functions.Veterinary Medicine International，2011.

[5]Garrido N, et al. Pro-oxidative and anti-oxidative imbalance in human semen and its relation with male fertility [J].Asian journal of andrology, 2004， 6(1): 59-66.