黃 英，馬艷輝，王 娟，陶 朱，薛賽鳳，祝黔江

(1.貴州大學(xué)西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴州貴陽550025;2.貴州大學(xué)大環(huán)化學(xué)及超分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025)

瓜環(huán)(Cucurbit［n］urils，Q［n］s)由于其“外親水，內(nèi)疏水”的特性［1－2］，作為一種潛在的藥物運(yùn)轉(zhuǎn)、緩釋或控釋載體，能達(dá)到增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性、改善藥物毒性等功效［3－5］。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一種常見的難溶性抗腫瘤藥物，屬細(xì)胞周期特異性藥物，能抑制RNA和DNA的合成，殺傷各期增殖細(xì)胞，對(duì)多種動(dòng)物腫瘤有免疫抑制作用，在臨床上適用于絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、急性淋巴細(xì)胞白血病及急性非淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病的急變期等［6］。本研究組曾報(bào)道了八元瓜環(huán)可與抗癌藥物甲氨蝶呤形成超分子復(fù)合物［7］，并探討了主客體的作用模式及影響條件。但由于八元瓜環(huán)在水中的溶解度極差(＜0.01 mM)，限制了其在藥物載體方面的應(yīng)用研究。七元瓜環(huán)在水中的溶解度(20～30 mM)與β－環(huán)糊精(16 mM)相當(dāng)［8］，在改善藥物穩(wěn)定性、溶解性等方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此，本文研究了七元瓜環(huán)(Q［7］)對(duì)甲氨蝶呤(MTX)的分子識(shí)別作用(其結(jié)構(gòu)見圖1)，及其藥物質(zhì)子化形式對(duì)主客體作用的影響、作用體系光化學(xué)特性的變化等，初步探討了瓜環(huán)對(duì)難溶性抗癌藥物溶解度及溶出度的影響，為瓜環(huán)在抗癌藥物載體方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

圖1 七元瓜環(huán)及甲氨蝶呤的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of cucurbit［7］urils and MTX

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent 8453型紫外－可見分光光度計(jì)(美國Agilent有限公司);HS－3C型pH計(jì)(上海濟(jì)成分析儀器有限公司)。試驗(yàn)中所用七元瓜環(huán)(Q［7］)為實(shí)驗(yàn)室自制，甲氨蝶呤(MTX)購自Sigma公司，水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 紫外吸收光譜研究Q［7］與MTX的相互作用 將MTX配制成1×10－3mol/L的溶液，Q［7］配制成2×10－4mol/L的溶液。在4 mol/L HCl溶液、0.01 mol/L HCl溶液及0.1 mol/L NaOH溶液中，測定MTX(20μmol/L)及MTX－Q［7］(20μmol/L MTX+20μmol/L Q［7］)紫外可見吸收光譜。

采用摩爾比法即固定MTX(20μmol/L)的濃度，改變瓜環(huán)的濃度，配制一系列不同物質(zhì)的量之比(NQ［7］/NMTX=0，0.2，0.4，…，3.0)的主客體溶液;采用等摩爾連續(xù)變化法溶液，配制成NMTX/NQ［7］+MTX=0，0.1，0.2，0.3，…，1.0一系列溶液，在0.01 mol/L HCl介質(zhì)中測定體系的紫外吸收光譜。

1.2.21H NMR譜的測定1H NMR譜在20℃下用VARIAN INOVA－400 MHz核磁共振儀測定，氘代水為溶劑。

1.2.3 相溶解度法測定［9］精確稱取一定量的MTX分別置于15支不同的試管中，分為3組。每組精確稱取Q［7］5、10、15、20、25 mg分別加入不同試管中，加入10 mL不同pH的緩沖溶液。超聲30 min，將試管置于25℃的水浴振蕩器中振蕩2 d，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。濾液用水適當(dāng)稀釋后用紫外分光光度計(jì)測定其在最大波長處(304 nm)的吸光度，計(jì)算藥物含量。以Q［7］含量為橫坐標(biāo)，藥物含量為縱坐標(biāo)，繪制相溶解度曲線。

1.2.4 瓜環(huán)對(duì)吉非替尼溶出度的影響 采用《中國藥典2005版》二部附錄溶出度測定法中的第三法小杯測定法［10］，分別精確稱取一定量的藥物、瓜環(huán)與客體包合物(NQ［7］/NMTX=1∶1)置于緩沖溶液中，轉(zhuǎn)速為50 rpm/min，溫度為(37±0.5)℃。定時(shí)取釋放液，同時(shí)向釋放體系補(bǔ)充相同體積的新鮮介質(zhì)，以維持釋放體系的體積不變。釋放液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，適當(dāng)稀釋后測定其紫外吸收強(qiáng)度A，根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Q［7］與MTX相互作用的紫外 －可見光譜分析

MTX存在5個(gè)電離平衡［11］，其電離平衡常數(shù)(pK)分別為:N(1)，pK1 4.70，α －COOH，pK1 3.36;N(10)，pK1 0.50;N(5)，pK1＜ －1.5。為簡化pK值對(duì)主客體包結(jié)平衡的影響，選擇MTX的單離子(MTX+，N(1)質(zhì)子化，0.01 mol/L HCl)、雙離子(MTX2+，N(1)及N(10)雙質(zhì)子化，4 mol/L HCl)及中性存在形式(MTX，0.1 mol/L NaOH)。在上述3種存在形式時(shí)，分別對(duì)MTX及Q［7］－MTX體系的紫外吸收光譜進(jìn)行測定，如圖2－a、2－b及2－c所示:在MTX2+及MTX存在形式時(shí)，加入Q［7］，并未使MTX2+及MTX的紫外吸收光譜發(fā)生變化(圖2－a及2－c);而在MTX+存在形式下(圖2－b)，在 λmax=304 nm處(Q［7］在此波長無吸收)，加入Q［7］，使得MTX+－Q［7］體系的光譜吸收強(qiáng)度減小，吸收峰紅移，表明Q［7］與MTX+發(fā)生了主客體相互作用。

為進(jìn)一步了解Q［7］與MTX+相互作用的情況，本文選用摩爾比法及Job法，考察了Q［7］與MTX在0.01 mol/LHCl介質(zhì)中的相互作用情況(圖3、圖4)。MTX在304 nm處有最大吸收峰，當(dāng)加入Q［7］后，體系的紫外吸收強(qiáng)度隨著Q［7］濃度的增加而降低，且最大吸收峰從304 nm移到320 nm，紅移了10 nm，并且在314 nm和345 nm處出現(xiàn)了兩個(gè)等吸收點(diǎn)，表明MTX與Q［7］形成了主客體配合物(圖3)。從A～NQ［7］/NMTX變化曲線(圖4)可以看出，當(dāng)主客體物質(zhì)的量之比為2∶1時(shí)，吸收強(qiáng)度出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，且隨Q［7］濃度的增大吸收強(qiáng)度不再改變，提示主客體之間形成了2∶1的包結(jié)配合物。Job法也得到了相同的結(jié)果(圖4－插圖)，其包結(jié)平衡常數(shù)為:(9.55±0.37)×1011L2·mol－2。

圖2 MTX與Q［7］－MTX(1∶1)體系在3種離子形式時(shí)的紫外吸收光譜Fig.2 UV-Vis spectra of three ionic forms of MTX and the corresponding Q［7］-MTX system

圖3 MTX隨著Q［7］濃度增加的紫外可見吸收光譜圖Fig.3 Electronic absorption spectra of MTX with the increased concentrations of Q［7］

圖4 A～NQ［7］/NMTX曲線Fig.4 A～NQ［7］/NMTX curve

2.2 1 H NMR的測定

圖5給出了Q［7］與MTX作用體系的1H NMR譜圖。相對(duì)于游離MTX來說，加入Q［7］后，復(fù)合物中MTX分子中碟啶環(huán)上質(zhì)子H7向高場移動(dòng)了約1.0 ppm，N10上的甲基質(zhì)子共振峰H10及苯環(huán)上質(zhì)子共振峰H3’及H5’向高場分別移動(dòng)了約0.3 ppm及0.1 ppm，H9質(zhì)子峰隱沒入了水峰中，說明MTX分子的碟啶環(huán)、甲基及苯環(huán)的部分進(jìn)入了七元瓜環(huán)的空腔受到屏蔽作用。同時(shí)苯環(huán)上質(zhì)子峰H2’及H6’向低場移動(dòng)了約0.2 ppm，谷氨酸上α、β及γ基碳上的氫質(zhì)子共振峰的化學(xué)位移均向低場移動(dòng)，表明MTX的這些部分受到了瓜環(huán)端口羰基氧的去屏蔽作用，而Q［7］端口形成了部分包結(jié)的主客體包合物。在研究聯(lián)苯胺在與對(duì)稱四甲基六元瓜環(huán)(TMeQ［6］)作用時(shí)，本研究組發(fā)現(xiàn)，其作用模式為端口作用，其作用平衡常數(shù)達(dá)到1010L2·mol－2的數(shù)量級(jí)［12］。由上述紫外可見吸收光譜數(shù)據(jù)可知，Q［7］與MTX的主客體作用計(jì)量比為2∶1，包結(jié)平衡常數(shù)為(9.55±0.37)×1011L2·mol－2。結(jié)合上述1H NMR作用模式分析，推測Q［7］與MTX的可能作用模式為圖5－c。

2.3 Q［7］對(duì)MTX溶解度及溶出度的影響

MTX溶解度隨pH變化如圖6所示。由圖6可知，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，MTX的溶解度較大，隨著酸度和堿度的降低，MTX的溶解度逐漸降低，在pH 3～9時(shí)，溶解度幾乎穩(wěn)定不變。因此，選擇pH=3.20、pH=6.50、pH=8.50來研究瓜環(huán)對(duì)MTX的增溶效應(yīng)。

采用相溶解度法時(shí)，Q［7］對(duì)MTX的溶解度影響如圖7所示。由圖7可知，在3個(gè)不同pH條件下，隨著Q［7］濃度的增加，MTX的溶解度均逐漸增大;在pH=3.20時(shí)，MTX的溶解度增加得最明顯;而在pH=6.50及pH=8.20時(shí)，MTX的溶解度增加次之。當(dāng)Q［7］濃度達(dá)到6 mM時(shí)，在pH=3.20時(shí)，MTX的溶解度大約增加了8.5倍，pH=6.50時(shí)，MTX的溶解度大約增加了5.6倍;而pH=8.20時(shí)，MTX的溶解度大約增加了4倍。上述結(jié)果表明，Q［7］對(duì)MTX有一定的增溶作用，且Q［7］對(duì)MTX的增溶效果受溶液酸堿度的影響。

圖5 MTX與Q［7］相互作用的1 H NMR譜圖Fig.5 1 H NMR spectra(400 MHz，D20)of interaction between MTX and Q［7］

圖6 MTX在不同pH條件下的溶解度曲線Fig.6 The solubility curve of MTX in different pH

圖7 在不同pH條件下Q［7］－MTX作用體系的相溶解度圖Fig.7 Phase solubility diagrams of the Q［7］-MTX system at different pH

為了探討Q［7］@MTX超分子體系對(duì)藥物溶出度的影響，根據(jù)《中國藥典2005版》二部附錄溶出度測定法中的第三法小杯測定法［10］，本文對(duì)MTX及Q［7］@MTX包合物的累計(jì)溶出度進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。從表1可知，MTX在pH=7.0左右的磷酸緩沖液環(huán)境中溶出速度較慢，2 min時(shí)累計(jì)溶出度為2.45%，隨著時(shí)間的增加藥物溶出度有一定增強(qiáng)，但變化不大，40 min時(shí)約溶出9.24%。對(duì)于Q［7］@MTX包合物來說，在相同介質(zhì)中溶出速度較單純藥物MTX明顯加快，在2 min時(shí)累計(jì)溶出度達(dá)到63.93%，13 min時(shí)可溶出80.56%，然后隨著時(shí)間的延長累計(jì)溶出度幾無變化，表明七元瓜環(huán)可改善抗癌藥物甲氨蝶呤的溶出度。

表1 MTX和Q［7］@MTX包合物累計(jì)溶出度Tab.1 The dissolution rate of MTX and Q［7］@MTX inclusion complexes

3 結(jié)論

Q［7］與MTX可形成2∶1主客體包結(jié)配合物，并且溶液的酸堿度影響主客體的相互作用，1H NMR法進(jìn)一步證實(shí)了Q［7］－MTX主客體配合物的形成。Q［7］可改善MTX的溶解度及溶出度，這將為瓜環(huán)作為藥物載體的研究提供一定的理論依據(jù)。

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