黑木耳提取物對(duì)膿毒血癥大鼠肝功能的保護(hù)作用*

孫 湛， 馬小娟， 姚雪萍， 于文燕， 馬 琪△

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1機(jī)能中心實(shí)驗(yàn)室， 2病理生理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830054)

黑木耳提取物對(duì)膿毒血癥大鼠肝功能的保護(hù)作用*

孫 湛1， 馬小娟2， 姚雪萍1， 于文燕2， 馬 琪1△

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1機(jī)能中心實(shí)驗(yàn)室，2病理生理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830054)

目的探討黑木耳提取物對(duì)膿毒血癥大鼠肝功能的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法40只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)抽取10只為假手術(shù)組，其余大鼠使用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法制備膿毒血癥動(dòng)物模型，分為CLP組、黑木耳粗提物組及黑木耳多糖組，術(shù)前3 d分別給予預(yù)防性灌胃，造模12 h后，下腔靜脈采血檢測(cè)肝功能指標(biāo)(ALT和AST)、內(nèi)毒素(ET)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和IL-6，取肝標(biāo)本做病理分析，免疫組織化學(xué)法觀察肝組織NF-κB的表達(dá)。結(jié)果應(yīng)用黑木耳粗提物及黑木耳多糖干預(yù)后，大鼠血清中ALT、AST、ET、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著低于CLP組(P<0.05)；肝組織病理改變減輕。CLP組肝細(xì)胞NF-κB強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；黑木耳粗提物組和黑木耳多糖組肝細(xì)胞NF-κB弱陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論黑木耳粗提物及黑木耳多糖在有效降低膿毒血癥大鼠血清ET的基礎(chǔ)上，同時(shí)降低TNF-α、IL-1β和IL-6含量，抑制膿毒血癥大鼠肝組織細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，對(duì)膿毒血癥大鼠肝臟功能有保護(hù)作用。

黑木耳提取物； 膿毒血癥； 肝功能； 全身炎癥反應(yīng)綜合征

膿毒血癥(sepsis)是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克和多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的發(fā)生，嚴(yán)重威脅患者生命。肝功能衰竭在各器官衰竭中發(fā)病率很高，肝細(xì)胞功能障礙又能誘發(fā)其它器官功能衰竭。因此，如何減輕膿毒血癥造成的肝功能損傷成為治療膿毒血癥的重要部分。隨著對(duì)膿毒血癥發(fā)病機(jī)制和病理進(jìn)程了解的不斷深入，現(xiàn)認(rèn)為膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制和造成的組織損傷是一系列細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)相互作用并作用于組織的結(jié)果[1]。

黑木耳是人們?nèi)粘Ｉ钪械奶烊晃镔|(zhì)，且在我國(guó)資源豐富，是一種藥食兩用大型真菌。目前已發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖(A.auricula-judaepolysaccharide)具有多種生物活性作用[2-4]，我們已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黑木耳粗提物(A.auricula-judaecrude extract)能明顯降低大鼠感染性休克過(guò)程血清中的內(nèi)毒素含量，并對(duì)于感染性休克造成的心功能損害有保護(hù)作用，能有效保護(hù)心臟功能[5]。本研究擬通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)復(fù)制膿毒血癥的急性肝損傷大鼠模型，探討黑木耳粗提物和黑木耳多糖在膿毒血癥大鼠模型中保護(hù)肝臟功能的作用，并探討其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)成年Wistar雄性大鼠40只，體重200～220 g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑及藥品 內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海潤(rùn)成生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和IL-6 ELISA試劑盒、NF-κB p65免疫組化抗體購(gòu)自北京永輝生物科技有限公司；顯色基質(zhì)鱟試劑盒上海榕柏生物技術(shù)有限公司；東北黑木耳購(gòu)自青島金海鷗水產(chǎn)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為QS370222010100。

2主要方法

2.1黑木耳粗提物和多糖的提取與純化 采用黑木耳干子實(shí)體熱水浸提法制備黑木耳提取物。稱(chēng)取一定量烤干至恒重的黑木耳樣品，粉粹后加40倍水，90 ℃浸提3.5 h，重復(fù)抽提3次，蒸發(fā)濃縮，獲得黑木耳粗提物。繼續(xù)在上清液加入4倍體積的分析純乙醇沉淀，沉淀即為黑木耳粗多糖。黑木耳粗多糖經(jīng)Sevage 法反復(fù)脫蛋白、離心，減壓濃縮、真空冷凍干燥后得到黑木耳多糖粉末，備用。

2.2膿毒血癥大鼠模型制備及分組 雄性Wistar大鼠40只，稱(chēng)重后隨機(jī)法分為假手術(shù)組、CLP組、CLP+黑木耳多糖組和CLP+黑木耳粗提物組，每組10只。術(shù)前灌胃3 d，假手術(shù)組和CLP組使用生理鹽水灌胃，黑木耳多糖組和黑木耳粗提物組分別給予1%黑木耳多糖和1%黑木耳粗提物灌胃，每隔8 h灌胃1次，劑量為15 mL/kg體重。應(yīng)用CLP法制備膿毒血癥動(dòng)物模型，手術(shù)區(qū)域5%碘酊消毒，75%乙醇脫碘2次，對(duì)照組大鼠開(kāi)腹分離腸系膜翻動(dòng)盲腸，不結(jié)扎穿刺，關(guān)腹；其余各組開(kāi)腹分離腸系膜，找出盲腸結(jié)扎穿刺。

2.3標(biāo)本采集 術(shù)后12 h，以20%烏拉坦1.5 g/kg的劑量腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，-20 ℃保存。取肝臟，用濾紙吸干表面血液后，取部分組織固定于甲醛中用于石蠟切片。

2.4檢測(cè)指標(biāo) 用顯色鱟試劑定量測(cè)定法測(cè)定血清內(nèi)毒素含量。血清TNF-α、IL-1β、IL-6、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平分別采用相應(yīng)的試劑盒嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。將石蠟包埋的肝組織制成4 μm厚的連續(xù)切片，用DAB法檢測(cè)NF-κB的蛋白表達(dá)情況。以PBS代替Ⅰ抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)作為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選取8個(gè)高倍視野，每組選取8張切片，經(jīng)Olympus圖像采集系統(tǒng)采集圖像，利用Image-Pro Plus 5.1分析軟件分析，每張切片于400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野彩圖，應(yīng)用Meta Morph軟件測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的積分吸光度(IA)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件檢查方差齊性，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1肝功能相關(guān)指標(biāo)的變化

CLP組、黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠血清ALT及AST水平均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預(yù)后，大鼠血清中ALT及AST水平明顯低于CLP組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Effects of different treatments on the serum levels of ALT and AST in sepsis rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCLP group.

圖1不同處理對(duì)膿毒血癥大鼠血清ALT及AST水平的影響

2各組大鼠肝組織病理變化

CLP組大鼠肝臟鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞胞膜下有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞呈片狀水腫，大小不均勻，匯管區(qū)血管擴(kuò)張充血，肝索排列已不清晰，胞核大小不規(guī)則；黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠肝臟光鏡下觀察少量散在的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞輕度腫脹，肝組織結(jié)構(gòu)基本完整，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The pathological changes of liver tissues in different groups(HE staining, ×400). A: control group; B: CLP group; C:A.auricula-judaecrude extract group; D:A.auricula-judaepolysaccharide group.

圖2各組肝臟組織病理學(xué)改變

3各組大鼠血清內(nèi)毒素的變化

與假手術(shù)組比較，CLP組、黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠血清內(nèi)毒素水平均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預(yù)后，大鼠血清內(nèi)毒素較CLP組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Effects of different treatments on the level of endotoxin(ET) in sepsis rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCLP group.

圖3不同處理對(duì)膿毒血癥大鼠血清內(nèi)毒素水平的影響

4各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的變化

CLP組、黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6較假手術(shù)組均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預(yù)后，大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平明顯低于CLP組， IL-6水平低于CLP組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Effects of different treatments on the level of TNF-α, IL-1β and IL-6 in sepsis rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCLP group.

圖4不同處理對(duì)膿毒血癥大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平的影響

5肝組織NF-κB的表達(dá)

假手術(shù)組肝細(xì)胞中NF-κB較弱地表達(dá)；CLP組肝細(xì)胞NF-κB強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與假手術(shù)組分別相比差異顯著(P<0.01)；黑木耳粗提物組及黑木耳多糖組肝細(xì)胞NF-κB呈弱陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖5、表1。

Figure 5. The expression of NF-κB in liver tissues (SP,×400). A: control group; B: CLP group; C:A.auricula-judaecrude extract group; D:A.auricula-judaepolysaccharide group.

圖5各組NF-κB在肝臟的表達(dá)情況

表1各組肝組織NF-κB的免疫組化圖像分析結(jié)果

Table 1. The result of NF-κB expression in liver tissues detected by immunohistochemistry (Mean±SD.n=10)

GroupNF-κBexpressionControl16395.57±463.96CLP75508.08±756.36**A.auricula-judaepolysaccharide22724.59±984.97##A.auricula-judaecrudeextract21869.63±953.28##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCLP group.

討 論

膿毒血癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷及大手術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥，臨床上常常伴有MODS，是ICU患者主要死亡原因之一。膿毒血癥急性肝損傷可發(fā)生在膿毒血癥的任何階段，膿毒血癥發(fā)展為多臟器功能衰竭的標(biāo)志之一是肝功能不全。膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要病理生理基礎(chǔ)是以細(xì)胞因子為代表的多種炎癥介質(zhì)的失控性釋放，某些介質(zhì)對(duì)膿毒血癥的產(chǎn)生和發(fā)展起十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CLP組大鼠血清中內(nèi)毒素水平高于假手術(shù)組，黑木耳粗提物組及黑木耳多糖組內(nèi)毒素水平明顯低于CLP組。CLP組反映肝功能的指標(biāo)(AST和ALT)較假手術(shù)組也明顯增高，黑木耳粗提物組及黑木耳多糖組AST和ALT水平均低于CLP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CLP組肝組織切片中顯示有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞呈片狀水腫，大小不均勻。以上肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變也都提示肝細(xì)胞有嚴(yán)重的損害，表明CLP組大鼠肝臟嚴(yán)重?fù)p害；而黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預(yù)組，肝臟損傷較CLP組輕。

在炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中，內(nèi)毒素可直接刺激細(xì)胞分泌TNF-α，TNF-α起著始動(dòng)作用，炎癥反應(yīng)過(guò)程中TNF-α是始動(dòng)因素，IL-1β則起到協(xié)同作用。IL-1β主要存在于血液循環(huán)中，是具有多向性生物功能的炎癥介質(zhì)，能誘發(fā)機(jī)體代謝和血流動(dòng)力學(xué)明顯變化，促進(jìn)炎癥介質(zhì)生成，導(dǎo)致炎性因子“瀑布效應(yīng)”， IL-6具有強(qiáng)烈的中性粒細(xì)胞趨化作用和激活作用。NF-κB是多種促炎癥基因高度轉(zhuǎn)錄的必需因子，可以促進(jìn)與TNF-α等炎癥因子有關(guān)的多種基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與不同原因引起的組織損傷過(guò)程[6-7]。本研究中，CLP組、黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6較假手術(shù)組均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，給予黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預(yù)后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯低于CLP組。假手術(shù)組肝細(xì)胞中NF-κB較弱地表達(dá)，CLP組肝細(xì)胞NF-κB強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而干預(yù)各組肝細(xì)胞NF-κB較CLP組表達(dá)弱。

黑木耳是人們?nèi)粘Ｉ钪械某Ｒ?jiàn)真菌類(lèi)植物，有藥食兩大功能，在《神農(nóng)本草》和《本草綱目》中均有介紹，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳中的黑木耳多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、降血脂、抗氧化等多種生物活性。我們已發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖在感染性休克、膿毒血癥時(shí)具有抗炎作用，并且能保護(hù)心功能。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用黑木耳提取物給膿毒血癥大鼠進(jìn)行預(yù)防性灌胃，對(duì)大鼠的肝臟起到保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制全身炎癥反應(yīng)有關(guān)。另外，通過(guò)不同的提取方式獲得黑木耳多糖及黑木耳粗提物，這兩種提取物對(duì)膿毒血癥大鼠的保護(hù)作用沒(méi)有顯著差異，對(duì)于黑木耳提取物的有效成分還有待于進(jìn)一步研究。

[1] Sriskandan S, Altmann DM. The immunology of sepsis[J]. J Pathol, 2008, 214(2): 211-223.

[2] 葉挺梅，孫麗娜，蘇 方，等. 黑木耳多糖對(duì)急性腦缺血/再灌注損傷影響的研究[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2010, 26(4):423-426.

[3] 盧舜飛，孫麗娜，沈 佳，等. 黑木耳多糖對(duì)抗大鼠慢性缺血性腦損傷[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 26(4):721-724.

[4] 馬小娟，馬 琪，于文燕，等.黑木耳粗提物在大鼠急性腎功能衰竭過(guò)程中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志,2013,29(7):1235-1238.

[5] 馬 琪，劉熠雯，馬小娟，等. 黑木耳粗提物對(duì)大鼠感染性休克過(guò)程中腸道內(nèi)毒素的吸附作用[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 32(12): 1683-1685.

[6] 詹志林，江 濱，周 琎，等. 核因子κB活化在膿毒血癥急性肝損傷發(fā)病中的作用機(jī)制[J].江蘇醫(yī)藥,2008,34(1):69-72.

[7] Angus DC, van der Poll T. Severe sepsis and septic shock[J]. New Engl J Med, 2013, 369(9): 840-851.

ProtectiveeffectofA.auricula-judaeextractsonliverfunctioninsepticrats

SUN Zhan1, MA Xiao-juan2, YAO Xue-ping1, YU Wen-yan2, MA Qi1

(1LaboratoryofFunctionalScience;2DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China.E-mail:maqi1111@126.com)

AIM: To explore the effects ofAuricularia(A.)auricula-judaeextracts on the liver function in septic rats.METHODSForty male Wistar rats were randomly divided into control group, model group,A.auricula-judaepolysaccharide group andA.auricula-judaecrude extract group. Septic model was induced by the procedure of cecal ligation and puncture (CLP). Intragastric administration was performed every 8 h 3 days prior to CLP. The plasma levels of alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), endotoxin(ET), tumor necrosis factor α(TNF-α), interleukin 6(IL-6) and IL-1β were detected 12 h after CLP. The specimens of the liver were collected to observe the pathological changes. The expression of NF-κB in the liver tissues was detected by the method of immunohistochemistry.RESULTSCompared with the CLP rats, the intervention ofA.auricula-judaepolysaccharide andA.auricula-judaecrude extract to the septic rats significantly decreased the serum levels of ALT, AST, ET, TNF-α, IL-1β and IL-6 (P<0.05). The pathological changes of the liver tissues in treatment groups were significantly attenuated compared with CLP group.CONCLUSIONA.auricula-judaepolysaccharide andA.auricula-judaecrude extract protect liver against sepsis-induced injury by inhibiting the systemic inflammatory response.

Auriculariaauricula-judaeextract; Sepsis; Liver function; Systemic inflammatory response syndrome

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.028

1000- 4718(2013)11- 2072- 04

2013- 04- 17

2013- 09- 24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81260454)

△通訊作者 Tel: 0991-4365064; E-mail: maqi1111@126.com