動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 竇茂鑫 趙 迪 侯永清 吳 濤

百里香芳香油除能賦予食品香氣以外，還具有防腐和抗氧化的作用（樊明濤和陳錦屏，2002）。百里香芳香油的主要成分是百里香酚和香芹酚，二者的含量總和是衡量百里香芳香油質(zhì)量的重要指標(biāo)（張知俠，2004）。本研究建立了檢測飼料添加劑百里香油中香芹酚和百里香酚高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Waters 1525型，配Waters 2489檢測器）；超聲波清洗器；電子天平（精度 0.0001 g）。

1.2 試劑 甲醇、冰醋酸為色譜純；試驗(yàn)用超純水；香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度 ≥ 99%）；百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度 ≥99%）。

1.3 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（2）柱（粒度為 5 μm，柱規(guī)格為 250 mm×4.5 mm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（60∶4∶2，V∶V∶V）；檢測波長：274 nm，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為 20 μL；柱溫：30 ℃。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密量取香芹酚0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成香芹酚含量為1%的貯備液；精密稱取百里香酚0.5 g，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成百里香酚濃度為10 mg/mL的貯備液。然后用甲醇將香芹酚貯備液稀釋成含量 分 別 為 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 μL/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，用甲醇將百里香酚貯備液稀釋成濃度為5.0、10.0、50.0、100.0、250.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.5 樣品溶液的制備 精密量取百里香油樣品0.1 mL置于250 mL容量瓶中，加200 mL甲醇超聲提取30 min，冷卻后用甲醇定容，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后制得供試樣品溶液。

1.6 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取5份已知含量的百里香油供試樣品，分別添加已知含量的香芹酚和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品，測定兩者的回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 由圖1可見，香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離，峰形對稱，無雜質(zhì)峰干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將百里香酚和香芹酚系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別取20 μL進(jìn)樣，測定積分值，以峰面積為縱坐標(biāo)，以百里香酚和香芹酚含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

百里香酚：Y=10372X+43944，R2=0.9995；

香芹酚：Y=10138X+42475，R2=0.9993；

結(jié)果表明，百里香酚濃度為5～500 μg/mL線性關(guān)系良好，香芹酚濃度為為0.01～0.4 μL/mL也呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取100 μg/mL的百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和0.1 μL/mL的香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣 5次，測定峰面積（表 1）。求得百里香酚和香芹酚峰面積的RSD分別為0.64%和0.89%，說明此方法具有較好的精密度。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（峰面積）

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按1.5中的方法制成的5份百里香油供試樣品中百里香酚和香芹酚含量如表2和表3所示。實(shí)驗(yàn)測得百里香酚和香芹酚的平均含量分別為22.70%和5.12%，變異系數(shù)分別為0.86%和1.35%，說明方法重現(xiàn)性良好。

2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取5份已知含量的百里香油供試樣品5 mL，分別置于5個(gè)50 mL容量瓶中，然后分別添加濃度為100 μg/mL百里香酚標(biāo)準(zhǔn)液和0.1 μL/mL香芹酚標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測定，測得結(jié)果見表4、表5。從表4和表5可見，百里香酚和香芹酚的平均回收率為98.42%和97.81%，RSD分別為1.18%和0.90%，說明該方法回收率高。

3 小結(jié)

本研究建立了飼料添加劑百里香油中香芹酚和百里香酚的檢測方法。實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇、無水乙醇和95%乙醇超聲提取30 min，結(jié)果表明，無水乙醇和95%乙醇提取的回收率相仿，略低于甲醇提取的回收率。因此本實(shí)驗(yàn)選用甲醇超聲提取 30 min，采用 Diamonsil C18（2）柱分離，Waters 2489 檢測器檢測，以甲醇-水-冰醋酸（60∶4∶2，V∶V∶V）為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，此方法香芹酚和百里香酚得到很好的基線分離，且重復(fù)性好、回收率高，可以作為百里香油中香芹酚和百里香酚的檢測方法。

表2 百里香油中百里香酚含量測定結(jié)果

表3 百里香油中香芹酚含量測定結(jié)果

表4 百里香油中百里香酚回收率測定結(jié)果

表5 百里香油中香芹酚回收率測定結(jié)果

[1]樊明濤，陳錦屏.百里香芳香油及其主要成分抗氧化試驗(yàn)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，11（1）：34 ～ 36.

[2]張知俠.百里香芳香油化學(xué)成分的研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（3）：151～153.