農(nóng)曉琳，陳 洪，李佳荃，陳石海，鄧 凌，唐黎黎，李菊裳

1廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科;2廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;3廣西大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院整形美容科;4廣西大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院皮膚性病科，南寧 530021

人皮膚瘢痕的形成主要是由于成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖。因此，抑制皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為是防治瘢痕形成的關(guān)鍵，但目前對(duì)于皮膚瘢痕的藥物治療大多僅限于基礎(chǔ)研究，未能廣泛應(yīng)用于臨床。水蛭素(Hirudin)是凝血酶的特異性抑制劑，有研究發(fā)現(xiàn)水蛭素可以抑制細(xì)胞的增殖［1］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)和兔耳增生性瘢痕模型的建立，觀察水蛭素對(duì)人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響以及自制的水蛭素膏劑對(duì)兔耳瘢痕的抑制作用，為臨床應(yīng)用水蛭素治療皮膚瘢痕提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜DMSO(美國(guó)Sigma公司);細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche Diagnostics);白凡士林、單硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸鈉、甘油均購(gòu)自南寧拜爾公司;十八醇、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(廣西西隴化工有限公司);天然水蛭素由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供;

1.2 儀器與設(shè)備

ELX-800型酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司);病理圖象分析儀(型號(hào):DMR+Q550，德國(guó))。

1.3 細(xì)胞來(lái)源

瘢痕組織標(biāo)本供體均來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)整形外科的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)為近期未使用瘢痕抑制藥物，不伴有其他系統(tǒng)性疾病，取材前均經(jīng)患者知情同意。前后共培養(yǎng)6例瘢痕患者的皮膚成纖維細(xì)胞，其中男3例，女3例，瘢痕增生時(shí)間在1～3年左右。

1.4 方法

1.4.1 人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

在無(wú)菌條件下采集手術(shù)切除的皮膚瘢痕組織后立即放入含500 U/mL青霉素和500 mg/L鏈霉素的培養(yǎng)基中。無(wú)菌條件下用手術(shù)刀片和剪刀去除表皮和基底層，用D’hanks液將標(biāo)本反復(fù)洗滌。將清洗干凈的皮膚瘢痕組織剪成3×3×2 mm大小的組織塊。將組織塊移入50 mL培養(yǎng)瓶中，均勻地貼在瓶壁上，間距約1 cm。瓶?jī)?nèi)加入含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1.5 mL，密閉瓶口。2 d以后再補(bǔ)加3～5 mL培養(yǎng)液，此后3～4 d更換一次培養(yǎng)液。待成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。通過(guò)傳代去除非成纖維細(xì)胞成分，獲得人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)取第3～4代的成纖維細(xì)胞用于試驗(yàn)。抗波形蛋白抗體免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞。

1.4.2 水蛭素對(duì)成纖維細(xì)胞的作用

1.4.2.1 MTT法測(cè)定水蛭素對(duì)人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖影響作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞3～4代，用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)為0.5×105/mL，分別接種于96孔塑料培養(yǎng)板，密度為0.5×104個(gè)/孔，每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液和100 μL的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后吸棄原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分組:1、水蛭素組:加入已經(jīng)配置的含水蛭素濃度為 5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 U/mL的培養(yǎng)基200 μL;2、對(duì)照組:每孔只加200 μL 的培養(yǎng)基。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃，5%CO2飽合濕度繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入200 μL DMSO，振蕩，待結(jié)晶顆粒溶解后，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值。記錄結(jié)果，采用概率單位法(Probit)計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。計(jì)算藥物對(duì)皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制率。生長(zhǎng)抑制率 =(1-A用藥組/A對(duì)照組)×100%。

1.4.2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)的計(jì)算

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞3～5代用0.25%的胰酶消化后，接種在6孔板上，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)1 d，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后用水蛭素IC50的濃度作用于成纖維細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)1d后將培養(yǎng)基吸出后放入離心管，然后用0.25%胰酶將貼壁的細(xì)胞消化后放入同一離心管，1000 rpm離心，5 min收集細(xì)胞，0.1%多聚賴(lài)氨酸處理玻片后，細(xì)胞涂片，室溫下自然晾干。晾干后用PBS沖洗2次，40 g/L多聚甲醛室溫下固定10 min，PBS沖洗。加入用Tris緩沖鹽溶液(TBS)新鮮稀釋的蛋白酶K(比例為1∶100)，37℃下作用10 min。蒸餾水洗滌，加入含末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶TdT和地高辛標(biāo)記的脫氧尿苷5-三磷酸(dUTP)標(biāo)記緩沖液20 μL，37℃下放置2 h。TBS洗滌，加入封閉液50 μL室溫放置30 min，甩干;加 Anti-DIG-Biotin。加 SABC后，采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色20 min，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染，TBS洗滌、脫水、封固。將切片置于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核中有棕色顆粒者為凋亡細(xì)胞。用病理圖像分析儀在凋亡細(xì)胞密集區(qū)于400倍鏡下連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的凋亡細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞率即凋亡指數(shù)AI。

1.4.3 水蛭素瘢痕膏劑對(duì)兔耳瘢痕的作用

1.4.3.1 兔耳瘢痕動(dòng)物模型的建立

用3只大耳新西蘭白兔，在兔耳雙側(cè)腹側(cè)分別做相同的6個(gè)直徑為1 cm的圓形切口，共作創(chuàng)面36個(gè)，完整切除全層皮膚，直至軟骨膜。

1.4.3.2 膏劑的制備

基質(zhì)對(duì)照組膏劑的制備:油液:取白凡士林2.4 g、十八醇1.6 g和單硬脂酸甘油酯0.4 g置于蒸發(fā)皿中，水浴加熱至70～80℃使其熔化，水液:將十二烷基硫酸鈉0.2 g、甘油1.4 g、對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.04 g和計(jì)算量的蒸餾水置另一蒸發(fā)皿中加熱至70～80℃使其溶解，在同溫下將水液以細(xì)流加到油液中，邊加邊攪拌至冷凝，即得乳劑型基質(zhì)，制備基質(zhì)20 g為對(duì)照組膏劑;水蛭素組膏劑的制備:制備膏劑20 g，濃度為7.5%。

1.4.3.3 組別及處理

動(dòng)物隨機(jī)平均分為3組，每組12個(gè)瘢痕，于術(shù)后28 d(創(chuàng)面均已上皮化)，開(kāi)始對(duì)實(shí)驗(yàn)組外涂膏劑，每日3次，A組為水蛭素組，B組為單純基質(zhì)對(duì)照組，C組為不加處理的空白對(duì)照組。

1.4.3.4 標(biāo)本取材及處理

術(shù)后56 d，處死動(dòng)物后切取兔耳瘢痕標(biāo)本，令標(biāo)本周邊帶有少許正常組織。所有取材的標(biāo)本經(jīng)瘢痕凸起最高點(diǎn)沿瘢痕最大徑方向，將瘢痕分切為2部分，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制取最大斷面切片，行HE染色及VG染色。

1.4.3.5 觀察指標(biāo)

①大體觀察;②光鏡下觀察;③瘢痕增生指數(shù)(Hypertrophic Index，HI):HE染色切片于低倍鏡下用顯微測(cè)量標(biāo)尺測(cè)量，按公式HI=A/B(見(jiàn)圖1)計(jì)算瘢痕增生指數(shù);④成纖維細(xì)胞數(shù)密度(Numerical density on area，NA):400倍光鏡下觀察瘢痕HE染色切片，在瘢痕中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取5個(gè)矩形視野(0.00505 mm2)，目測(cè)計(jì)數(shù)并計(jì)算切片內(nèi)單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果取均數(shù);⑤膠原纖維的面密度(Area density on area，AA):VG染色組織切片，在瘢痕中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取5視野，利用計(jì)算機(jī)輔助病理圖象分析系統(tǒng)計(jì)算紅染之膠原纖維的面密度，結(jié)果取均數(shù)。

圖1 瘢痕增生指數(shù)HI計(jì)算示意圖Fig.1 Illustration plot for the calculation of hypertrophic index

1.4.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS10.0軟件，計(jì)量資料采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)及鑒定

7～12 d可見(jiàn)組織塊周邊細(xì)小芽狀貼壁細(xì)胞爬出，放射狀生長(zhǎng)，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。光鏡下細(xì)胞胞體狹長(zhǎng)、透亮，胞膜清晰，呈典型的梭形和不規(guī)則三角形，圖2-a;HE染色見(jiàn)成纖維細(xì)胞胞漿豐富，色淡紫，胞核大，色藍(lán)，位于細(xì)胞中央，圖2-b。免疫組化染色抗波形蛋白抗體染色陽(yáng)性，細(xì)胞漿棕色顆粒樣著色，提示所得細(xì)胞為間葉組織來(lái)源，符合成纖維細(xì)胞特性。

圖2 人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定Fig.2 Cultivation and identification of skin scar derive fibroblasts

2.2 水蛭素對(duì)成纖維細(xì)胞的影響

2.2.1 MTT法檢測(cè)的結(jié)果

水蛭素濃度為0.078～5 U/mL時(shí)與空白對(duì)照組比較對(duì)細(xì)胞有明顯抑制作用(P＜0.01)(表1)，且呈濃度依賴(lài)性，水蛭素的濃度越高，對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制率越高，圖3。水蛭素對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的IC50=0.9 U/mL。

表1 水蛭素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響(±s)Table 1 Effect of hirudin on fibroblast proliferation(±s)

表1 水蛭素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響(±s)Table 1 Effect of hirudin on fibroblast proliferation(±s)

注:水蛭素各組與空白對(duì)照組A值相比較，＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜ 0.01.

組別(濃度)Grouping and concentration吸光度值A(chǔ)bsorbance抑制率(%)Inhibition rate(%)空白對(duì)照組Contral group 0.173±0.0012 -水蛭素組1 Hirudin group 1(0.078U/mL) 0.135±0.0040＊＊ 22.1±2.4水蛭素組2 Hirudin group 2(0.156U/mL) 0.134±0.0072＊＊ 22.7±4水蛭素組3 Hirudin group 3(0.313U/mL) 0.117±0.0053＊＊ 32.5±3.3水蛭素組4 Hirudin group 4(0.625U/mL) 0.101±0.0062＊＊ 41.3±3.6水蛭素組5 Hirudin group 5(1.25U/mL) 0.077±0.0046＊＊ 55.6±2.9水蛭素組6 Hirudin group 6(2.5U/mL) 0.066±0.0036＊＊ 61.9±2.3水蛭素組7 Hirudin group 7(5U/mL) 0.041±0.0026＊＊76.3±1.4

圖3 水蛭素對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of hirudin on the proliferation of scar derive fibroblasts

2.2 TUNEL法檢測(cè)水蛭素誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡的結(jié)果

水蛭素實(shí)驗(yàn)組，IC50=0.9 U/mL培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞體積縮小、胞質(zhì)少、密度變小，凋亡細(xì)胞多、呈棕黃色。而空白對(duì)照組的成纖維細(xì)胞體積大、胞質(zhì)豐富、密度大，圖4。水蛭素實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的細(xì)胞AI值高于空白對(duì)照組(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

Fig.4 Detection of fibroblasts apoptosis induced by hirudin with TUNEL assay(400×)圖4 TUNEL法檢測(cè)水蛭素誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡(400×)

表2 TUNEL法檢測(cè)水蛭素對(duì)成纖維細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用Table 2 Apoptosis of fibroblasts after hirudin treatment(TUNEL assay)

2.3 水蛭素瘢痕膏對(duì)兔耳瘢痕作用的結(jié)果

2.3.1 大體觀察

單純基質(zhì)對(duì)照組、空白對(duì)照組的瘢痕凸出皮緣，色紅，水蛭素組較單純基質(zhì)對(duì)照組和空白對(duì)照組的瘢痕平坦、柔軟，如圖5-1。

2.3.2 光鏡下觀察

HE和VG染色切片:3組瘢痕均厚于周邊正常皮膚，水蛭素組的瘢痕小于對(duì)照組。對(duì)照組的瘢痕較凸，水蛭素組的瘢痕較對(duì)照組的平坦、成纖維細(xì)胞較少，胞體減小，膠原纖維較稀疏，排列整齊。對(duì)照組的瘢痕膠原纖維紅染，排列紊亂(圖5)。

2.3.3 增生指數(shù)HI

水蛭素組分別與單純基質(zhì)對(duì)照組及空白對(duì)照組相比較有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而單純基質(zhì)對(duì)照組與空白對(duì)照組相比較，P＞0.05，提示這兩組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

圖5 水蛭素對(duì)兔耳瘢痕模型影響的形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Morphology observation on hirudin oniment treated rabbit ear skin scar model

表3 水蛭素對(duì)兔耳模型瘢痕增生指數(shù)的影響(±s)Table 3 Hypertrophic index of rabbit ear skin scar model(±s)

2.3.4 瘢痕成纖維細(xì)胞數(shù)密度NA(靶目標(biāo)數(shù)量/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積)

水蛭素組分別與單純基質(zhì)對(duì)照組和空白對(duì)照組相比較有顯著差異(P＜0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

表4 水蛭素對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞數(shù)密度的影響(±s)Table 4 Numerical density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

表4 水蛭素對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞數(shù)密度的影響(±s)Table 4 Numerical density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

注:水蛭素組分別與空白對(duì)照組、基質(zhì)對(duì)照組相比較，P=0.000，＊＊P＜0.01。Note:Hirudin group compare with control and matrix group，＊＊ P ＜0.01.

組別Grouping成纖維細(xì)胞數(shù)密度(細(xì)胞數(shù)/mm2)Numerical density on area(cell/mm2)空白對(duì)照組Control group 4662.95±485.47基質(zhì)對(duì)照組Matrix group 4771.53±355.93水蛭素組 Hirudin group 3724.846±442.73＊＊

2.3.5 膠原纖維的面密度AA

水蛭素組分別與單純基質(zhì)對(duì)照組和空白對(duì)照組相比較有差異(P＜0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表5。

表5 水蛭素對(duì)兔耳瘢痕模型膠原纖維的面密度的影響(±s)Table 5 Area density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

表5 水蛭素對(duì)兔耳瘢痕模型膠原纖維的面密度的影響(±s)Table 5 Area density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

注:水蛭素組分別與對(duì)照組、基質(zhì)相比較，P=0.000，＊＊P＜0.01。Note:Hirudin group compare with control and matrix group，＊＊ P ＜0.01.

組別Grouping膠原纖維的面密度Area density on area(%)空白對(duì)照組52.58±4.69基質(zhì)對(duì)照組 50.55±5.40水蛭素組 35.55±7.85＊＊

2.4 討論

瘢痕是在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中形成的一種皮膚疾患，病理上表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積和成纖維細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)［2］。成纖維細(xì)胞在瘢痕組織里起主要的作用，因此，抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為是防治瘢痕形成與發(fā)展的關(guān)鍵，皮膚瘢痕是一種難治的疾病，目前用于病理性瘢痕治療的藥物主要有激素、硅酮和抗腫瘤藥物等，但是這些藥物本身的毒副及療效不確定，使之具有局限性。作者致力于從中藥和天然藥提取物中篩選抗皮膚瘢痕的功效藥物，該方向有較大的研究發(fā)掘價(jià)值［3-5］。本實(shí)驗(yàn)選用水蛭素對(duì)皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞增殖抑制的研究以及對(duì)兔耳增生性瘢痕的作用檢測(cè)其抗皮膚瘢痕增生的療效并探索相關(guān)機(jī)理。

水蛭素分為天然水蛭素和人工水蛭素，本實(shí)驗(yàn)采用的是天然水蛭素。天然水蛭素是水蛭(螞蝗)唾液腺的一種分泌物質(zhì)，為作用較強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑。其由65個(gè)氨基酸殘基組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)為單鏈環(huán)肽化合物，與凝血酶結(jié)合可形成一種非共價(jià)復(fù)合物，這種復(fù)合物可以中和凝血酶，并且能抑制凝血酶結(jié)合的纖維蛋白原［1，6］，能特異性地抑制凝血酶的活性［7］，可調(diào)節(jié)堿性成纖維細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的分泌［9］，具有多方面的用途。水蛭素可以通過(guò)抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集和促進(jìn)血小板與凝血酶解離，導(dǎo)致血小板不能釋放血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)，從而抑制細(xì)胞增生。PDGF不僅是由血小板分泌的，還可由成纖維細(xì)胞等一些細(xì)胞產(chǎn)生。本項(xiàng)目組前期研究顯示水蛭素可通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)及膠原形成達(dá)到對(duì)瘢痕的抑制作用［8］，提示其具有進(jìn)一步深入研究及應(yīng)用的價(jià)值。

本研究采用濃度為0.078～5 U/mL水蛭素作用于皮膚瘢痕的成纖維細(xì)胞，MTT法檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該濃度范圍的水蛭素能抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，效果呈劑量依賴(lài)性。TUNEL法檢測(cè)水蛭素的凋亡率，比對(duì)照組高。本研究體外實(shí)驗(yàn)顯示:水蛭素可抑制人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的體外增殖。本研究利用水蛭素配制外用膏劑對(duì)兔耳皮膚瘢痕模型作用的初步篩選結(jié)果顯示:水蛭素組的兔耳瘢痕質(zhì)地柔軟且較平整，無(wú)明顯的充血情況。測(cè)量水蛭素組的瘢痕增高指數(shù)、瘢痕成纖維細(xì)胞數(shù)密度和膠原纖維的面密度，檢測(cè)顯示水蛭素組較對(duì)照組和空白對(duì)照組的低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE染色發(fā)現(xiàn)水蛭素組成纖維細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組的少，提示水蛭素可以抑制皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。VG染色后觀察見(jiàn)水蛭素組的膠原較對(duì)照組的稀疏，排列較整齊，水蛭素組的膠原纖維面密度AA較對(duì)照組的小，提示水蛭素可以抑制瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和膠原形成，從而抑制瘢痕組織的增生。

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