袁志輝

湖南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程系，永州 425100

果膠酶(E.C.3.2.1.15)是一類分解果膠質(zhì)的酶的總稱［1］，是含有多種組分的復(fù)合酶，在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、環(huán)境領(lǐng)域、生物技術(shù)領(lǐng)域、煙葉處理和飼料工業(yè)等行業(yè)或領(lǐng)域中具有廣泛用途［2-5］。天然來源的果膠酶廣泛存在于動植物和微生物中，但由于材料獲取不易、提取條件復(fù)雜等原因，動植物來源的果膠酶難以大規(guī)模的提取制備。而微生物具有生長周期短，培養(yǎng)條件簡單易控，分布范圍廣泛等優(yōu)勢，因此微生物成為果膠酶生產(chǎn)和提取的重要來源。

目前生產(chǎn)微生物果膠酶的菌種很多，來源極其廣泛，包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌和放線菌。如芽孢桿菌屬(Bacillus)、青霉屬(Penicillum)、歐文氏菌(Erwinia)、根霉屬(Rhizopus)、曲霉屬(Aspergillus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、側(cè)孢霉屬(Sporotrichum)、多子菌屬(Polyporus)、密螺旋體菌屬(Treponema)、酵母屬(Saccharomyces)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、螺孢菌屬(Spirillospora)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、毛霉屬(Mucor)、畢赤氏酵母屬(Pichia)等。細(xì)菌在微生物中具有生長時間更短，生長條件更為簡單的特點(diǎn)，因此本文以細(xì)菌為研究目標(biāo)，從富含果膠質(zhì)的土壤中篩選分離能高效產(chǎn)生果膠酶的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

湖南省永州市零陵區(qū)郊苧麻地表層土壤。

1.1.2 試劑

果膠，美國 Sigma公司產(chǎn)品;3，5-二硝基水楊酸、KH2PO4、K2HPO4、乙酸銅，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;乙二胺四乙酸二鈉，天津縱橫興工貿(mào)有限公司產(chǎn)品;蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;葡萄糖、蔗糖等均為國產(chǎn)化學(xué)分析純試劑。

富集培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏2，蛋白胨2，NaCl 5，K2HPO41，KH2PO40.3，pH 7.0-7.2，分別逐量加入果膠至5、10、15、20 g/L完成富集馴化過程。分離培養(yǎng)基(g/L):果膠 5，蛋白胨 20，酵母抽提物 5，NaCl 5，牛肉膏 5，瓊脂 20，pH 7.0-7.2。產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基(g/L):果膠10，LB肉湯培養(yǎng)基21，pH 7.0-7.2?；鶞?zhǔn)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 10，蛋白胨 10，K2HPO41，KH2PO40.3，pH 7.0-7.2。所有培養(yǎng)基均為121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 富集馴化

稱取土壤樣品1 g，加入到一個盛有99 mL無菌水帶有玻璃珠的三角瓶中，將樣品充分打散、混勻，即成10-2泥漿稀釋液，然后再按10倍稀釋法依次稀釋到10-5。吸取10 mL稀釋液至90 mL富集培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1～2 d。

1.2.2 初篩分離

取富集培養(yǎng)液10 mL梯度稀釋至10-5，然后取1 mL稀釋液均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板上37℃倒置培養(yǎng)1～2 d。將待鑒定的菌落用牙簽轉(zhuǎn)移到另一分離培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2～4 d;往培養(yǎng)皿中加入適量的飽和乙酸銅溶液，染色15 min;棄去染液，若細(xì)菌產(chǎn)生果膠酶，則在菌落的周圍會出現(xiàn)清晰的透明圈，依據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來選擇產(chǎn)酶菌株［6］。將得到的產(chǎn)酶菌株進(jìn)行劃線純化，用于下一步的復(fù)篩。

1.2.3 復(fù)篩及酶活測定

通過DNS法測定果膠酶活性進(jìn)行復(fù)篩［7］。將純化后的菌落接種到30 mL產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中，于37℃、180 rpm下振蕩培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液3000 rpm、4℃離心5 min，上清液即為粗酶液。取0.5%果膠溶液5 mL與5 mL粗酶液混合，37℃溫育0.5 h，沸水浴中加熱5 min滅活。取1 mL反應(yīng)液與1 mL DNS試劑、8 mL蒸餾水混合，沸水浴加熱5 min，迅速冷卻。用分光光度計(jì)在540 nm處測其吸光度值C。對照液配制:沸水浴加熱滅活10 min的0.5 mL的稀釋酶液與0.5 mL 0.5%果膠溶液充分混合。

隱匿陰莖是一種先天性外生殖器畸形，指原本正常的陰莖被埋藏于皮下，包皮口與陰莖根距離短。病因是由于胚胎發(fā)育期間，正常延伸至生殖結(jié)節(jié)的尿生殖竇遠(yuǎn)端發(fā)育不全所致[3]。外觀呈“鳥嘴樣”或“山丘樣”(圖1)。按壓陰莖周圍皮膚可暴露正常的陰莖體，放手后恢復(fù)原狀。兒童隱匿性陰莖的診斷成立，需要具備5個條件：①陰莖外觀似寶塔狀，②具有發(fā)育正常的陰莖體，③下按陰莖周圍組織可顯示陰莖全貌，松開后即恢復(fù)如初，④需排除其他先天性尿道疾患及海綿體發(fā)育不良的陰莖疾患，⑤排除肥胖病因。

酶活=(A×S×D×1000)/(0.5×10)

式中，A為吸光度，S為測得光吸收在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的半乳糖醛酸量，D為酶液的稀釋系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考王薇［1］等的方法。在以上測定條件下，1 min水解果膠產(chǎn)生1 μg還原糖(以半乳糖醛酸計(jì))所需酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

按《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)中菌種鑒定方法進(jìn)行。

1.2.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

分別將不同碳源、氮源、pH值替代基準(zhǔn)培養(yǎng)基中相應(yīng)因素及不同生長時間和生長溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取碳源濃度、氮源濃度及pH值3個重要因素，進(jìn)行3因素3水平L9(33)正交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)得出的最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并測定其酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

經(jīng)過富集培養(yǎng)基的馴化及分離培養(yǎng)基的初篩分離，從采集的土樣中共獲得能夠產(chǎn)生水解透明圈的菌株11株。DNS法測定酶活的結(jié)果表明，在篩選到的11個菌株中，最高酶活為312 U/mL，最低酶活為107 U/mL。將最高酶活的菌株命名為HYL6，將其作為進(jìn)一步研究對象。

2.2 菌株鑒定

HYL6菌株在分離培養(yǎng)基上的特征為:菌落較大，乳白色，表面干燥，中央有褶皺，不透明。油鏡觀察菌體形態(tài)及革蘭氏染色、芽孢染色結(jié)果顯示:菌體呈直桿狀，兩端為圓形，無莢膜，鞭毛側(cè)生，單個細(xì)胞大小約為0.8×3 μm，革蘭氏染色為陽性，產(chǎn)芽孢，大小約為0.8×1.5 μm，形狀圓柱形，位置靠近細(xì)胞中央。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。綜合菌落特征、菌體形態(tài)及生理生化特征，初步判斷HYL6為芽孢桿菌屬。

表1 HYL6菌株生理生化特性Table 1 Biochemical and physiological characteristics of strain HYL6

葡萄糖Glucose +蔗糖Sucrose +尿素Urea -明膠液化Gelatine hydrolysis +馬尿酸鹽Hippurate -D-阿拉伯糖 D-Arabinose +甘露醇Mannitol +M.R. +產(chǎn)氣Gas producing -接觸酶Catalase -V.P. -檸檬酸鹽利用Utilization of Citrate +吲哚Indole +溶菌酶Lysozyme +

2.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 最佳產(chǎn)酶時間

在產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中，37℃、180 rpm培養(yǎng)不同時間，菌株HYL6產(chǎn)果膠酶情況見圖1。由圖可知，培養(yǎng)液中果膠酶活力的變化趨勢與細(xì)菌的生長曲線較相似，即在細(xì)菌生長的不同階段，其產(chǎn)酶活力會發(fā)生變化，說明果膠酶的產(chǎn)生與其生長有著較為密切的關(guān)系。果膠酶活力在HYL6生長至34 h達(dá)到最大，為320 U/mL。

圖1 不同生長時間產(chǎn)酶活力曲線Fig.1 The curve of pectinase production at different growth period

2.3.2 最佳產(chǎn)酶溫度

在產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中，不同培養(yǎng)溫度、180 rpm培養(yǎng)34 h，菌株HYL6產(chǎn)果膠酶情況見圖2。由圖可知，發(fā)酵溫度為36℃時，果膠酶活力最高，為309 U/mL，此溫度與HYL6的最佳生長溫度37℃接近，因此也可以37℃作為最佳產(chǎn)酶溫度。生長溫度大于36℃時，果膠酶活力下降，在38℃時，下降幅度不大，酶活為298 U/mL。當(dāng)溫度高于38℃時，酶活出現(xiàn)明顯的下降，至42℃時，其活力降為143 U/mL。這種現(xiàn)象與HYL6在偏離最佳生長溫度之外的生長情況是一致的。

圖2 不同生長溫度下產(chǎn)酶活力Fig.2 Pectinase production at different culturing temperature

2.3.3 最佳產(chǎn)酶pH值

將HYL6接種于不同pH值的產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中，36℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)34 h，產(chǎn)果膠酶情況見圖3。從圖上可以看出，在pH6-8的范圍內(nèi)，HYL6都能產(chǎn)生較高的果膠酶活，其中在pH7.5時為最高的321 U/mL。

圖3 不同生長pH值下產(chǎn)酶活力Fig.3 Pectinase production at different culturing pH

2.3.4 最佳產(chǎn)酶氮源

將HYL6菌株接種于用10 g/L不同氮源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，pH 7.5、36℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)34 h，產(chǎn)果膠酶情況見圖 4。由圖可知，(NH4)2SO4為氮源時酶活最低102 U/mL，以蛋白胨為氮源時活力最高為204 U/mL。

圖4 不同氮源條件下產(chǎn)酶活力Fig.4 Pectinase production at different nitrogen sources conditions

2.3.5 最佳產(chǎn)酶碳源

用不同碳源取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，pH 7.5、36℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)34 h進(jìn)行最佳產(chǎn)酶碳源研究，結(jié)果見圖5。由圖可知，產(chǎn)酶活力最高碳源為可溶性淀粉，為321 U/mL。

圖5 不同碳源條件下產(chǎn)酶活力Fig.5 Pectinase production at different carbon sources conditions

2.3.6 果膠酶發(fā)酵最佳條件

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了3因素3水平的正交試驗(yàn)(3個重復(fù))，分析結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可知，對果膠酶發(fā)酵影響最大是pH值，發(fā)酵最佳的條件組合是A1B3C2即可溶性淀粉5 g/L，蛋白胨15 g/L，pH 值7時，36 ℃、180 rpm 振蕩培養(yǎng)34 h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用這一條件組合進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生的果膠酶活力可達(dá)415 U/mL。

表2 果膠酶發(fā)酵的正交試驗(yàn)表Table 2 Result of orthogonal test for pectinase fermentation

3 結(jié)論

從富含果膠質(zhì)的土壤中取樣，經(jīng)過確定一套有效可行的篩選方法，從中篩選出11株能夠在含果膠的平板上產(chǎn)生水解透明圈的細(xì)菌菌株。通過DNS法測定酶活，選擇一株產(chǎn)酶活力最高的菌株命名為HYL6，進(jìn)行鑒定及初步的發(fā)酵條件優(yōu)化研究。

HYL6菌株經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)初步確定為芽孢桿菌屬。通過一系列產(chǎn)酶因素的研究，確定最佳產(chǎn)酶生長時間為34 h，最佳產(chǎn)酶生長溫度為36℃，最佳利用碳源和氮源分別是可溶性淀粉和蛋白胨，pH值為7.5。在單因素研究的水平上選擇碳源、氮源、pH值進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果表明發(fā)酵最佳的條件組合是:可溶性淀粉5 g/L，蛋白胨15 g/L，pH值7時，36℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)34 h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確證了這一結(jié)果。

用HYL6菌株在正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件下進(jìn)行發(fā)酵，最高產(chǎn)酶活力可達(dá)415 U/mL，該結(jié)果與王媛等［8］的10758 U/mL相比有較大差距，但其所使用的菌株是何種何屬在結(jié)果中沒有報道，并且其所采用酶活單位在文中也沒有明確定義，因此不具可比性。而同是芽孢桿菌屬產(chǎn)果膠酶發(fā)酵條件研究的翟秋梅等［9］并沒有說明其產(chǎn)酶活力大小，因此也無從比較。因此只能從本文所篩選到的11株菌進(jìn)行比較，本研究所選擇的菌株產(chǎn)酶活力比篩選到的最低產(chǎn)酶活力高出大約4倍，具備進(jìn)一步研究的潛力如通過人工誘變的方法進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶活力。

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