田玄玄 阮祥燕* Montag Markus Liebenthron Jana Alfred O.Mueck

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100026;2.海德堡大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，海德堡69115;3.波恩大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)院卵巢組織凍存中心，波恩53012;4.德國圖賓根大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌與絕經(jīng)研究中心，圖賓根D-72076)

隨著癌癥治療學(xué)的進(jìn)步，年輕女性放化療后卵巢功能減退及喪失成為婦產(chǎn)學(xué)界面臨的重大問題。卵巢組織冷凍保存是繼胚胎冷凍和卵母細(xì)胞凍存之后的又一極具潛力的保存女性生殖功能的新技術(shù)［1］，然而，目前對于卵巢組織凍存方法及其質(zhì)量評估尚不確定。卵泡活性和卵巢組織內(nèi)分泌功能的保存是凍存技術(shù)應(yīng)用于臨床的前提和基礎(chǔ)。本研究使用程序冷凍法凍存人卵巢組織，并在解凍后行組織體外培養(yǎng)，通過比較冷凍前后卵泡的活性，及培養(yǎng)上清液中的雌二醇(estradiol，E2)水平，探討程序冷凍法對卵泡活性和卵巢內(nèi)分泌功能的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

人卵巢組織來自于德國波恩大學(xué)卵巢組織凍存中心用于研究的人卵巢組織，所有組織來源者已簽署知情同意書。乳腺癌1例，宮頸癌2例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡1例，腎母細(xì)胞瘤1例，患者年齡8～39歲，平均年齡(27.2 ±19.2)歲。

1.2 試劑

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(純度 ＞99.9%)，德國WAK-Chemie公司生產(chǎn);L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)液，德國Gibco公司生產(chǎn);血清替代液(serum substitute supplement，SSS)，美國Irvine Scientific 公司生產(chǎn);慶大霉素，美國Sigma公司生產(chǎn);AIM-V無血清培養(yǎng)液，德國Gibco公司生產(chǎn);熒光染色劑Calcein AM，美國Sigma公司生產(chǎn);膠原酶IA，美國Sigma公司;蔗糖，美國Sigma公司生產(chǎn);Gamete Buffer，COOK?公司生產(chǎn);杜氏磷酸緩沖液(dulbecco＇s phosphate buffered saline，DPBS)，德國PAA公司生產(chǎn)。(1)組織準(zhǔn)備液:L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10%SSS+1%慶大霉素;(2)冷凍液:L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10%SSS+1%慶大霉素+10%DMSO;(3)消化染色液:DPBS+0.2%Calcein AM+6 mg/mL膠原酶IA;(4)梯度解凍溶液(100 mL):DPBS+10%SSS+1%慶大霉素 +0.75 mol/L/0.625 mol/L/0.5 mol/L/0.375 mol/L/0.25 mol/L/0.125 mol/L蔗糖;(5)體外培養(yǎng)液:AIM-V培養(yǎng)液+10%SSS+1%慶大霉素+100mIU/mL rFSH。

1.3 方法

1.3.1 卵巢組織收集及處理

卵巢組織離體后置于4℃組織準(zhǔn)備液中，快速轉(zhuǎn)移至實驗室。組織準(zhǔn)備液沖洗2次，22號刀片去除肉眼所見的壞死組織、血管和髓質(zhì)組織［2］，使卵巢皮質(zhì)厚度約1 mm，取邊角組織用于研究。在體視顯微鏡下用眼科剪和眼科鑷將卵巢組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊。操作過程中組織必須浸在組織準(zhǔn)備液中，以上操作在4℃條件下40 min內(nèi)完成。將處理好的組織塊采用抽簽法隨機(jī)分為新鮮組、程序冷凍組、新鮮培養(yǎng)組、凍融后培養(yǎng)組4組，每組10塊。(1)新鮮組:直接進(jìn)行消化染色卵泡計數(shù);(2)程序冷凍組:程序冷凍14 d后解凍，染色卵泡計數(shù);(3)新鮮培養(yǎng)組:新鮮組織塊體外培養(yǎng)，檢測上清液中E2濃度，14 d后組織塊染色卵泡計數(shù);(4)凍融后培養(yǎng)組:程序冷凍14 d后解凍，組織體外培養(yǎng)，檢測上清液中E2濃度，14 d后組織塊染色卵泡計數(shù)。

1.3.2 組織消化、熒光染色、卵泡計數(shù)

組織置于平衡過夜的AIM-V培養(yǎng)液中(4孔板，200 μL/孔)，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 2 ～3 h 后轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)溫的消化染色液中(DPBS/CalceinAM/膠原酶 IA)，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1.5 ～2 h，待組織消化呈絮狀，吹打混勻，熒光顯微鏡下各級卵泡計數(shù)。Calcein AM是一種只對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色劑，能夠輕易穿透活細(xì)胞膜，有活性的卵泡被染色以后發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。卵泡分級參照Gougeon分級［3］標(biāo)準(zhǔn):始基卵泡—卵母細(xì)胞周圍包繞一層扁平的前顆粒細(xì)胞;初級卵泡—卵母細(xì)胞周圍包繞一層立方形的顆粒細(xì)胞;次級卵泡—卵母細(xì)胞周圍包繞兩層或兩層以上立方形的顆粒細(xì)胞。竇狀卵泡—兩層以上的顆粒細(xì)胞，卵泡內(nèi)有竇腔形成。

1.3.3 程序冷凍［4-5］

處理好的組織塊置于預(yù)冷的冷凍液中，4℃(冰面上)搖勻20 min，200 r/min，后轉(zhuǎn)移置凍存管內(nèi)，凍存液500 μL/管，計時25 min。程序降溫:4℃開始，以1℃/min的速度降至－2℃，以0.5℃/min的速度降至－4℃，以0.3℃/min的速度降至－7.5℃，平衡11 min，人工植冰，平衡10 min，以0.3 ℃/min的速度降至－42℃，以10℃/min的速度降至－140℃，投入液氮保存。

1.3.4 快速解凍［5］

將凍存管從液氮中取出，室溫靜置30 s后置于37℃水浴1～1.5 min，觀察待凍存管內(nèi)冰呈2～3 mm長時將凍存管取出，室溫下?lián)u勻，轉(zhuǎn)移組織塊置梯度解凍溶液:0.75 mol/L-0.625 mol/L-0.5 mol/L-0.375 mol/L-0.25 mol/L-0.125 mol/L，各搖勻 8 min，室溫，200 r/min;37℃預(yù)溫的Gamete Buffer液沖洗2次×15 s，將組織轉(zhuǎn)移置AIM-V液中培養(yǎng)過夜，消化染色、卵泡計數(shù)。

1.3.5 卵巢組織體外培養(yǎng)

將新鮮和解凍復(fù)蘇后的卵巢組織置入4孔板(美國Falcon公司)中進(jìn)行體外培養(yǎng)，每孔置1塊卵巢組織，置300 mL體外培養(yǎng)液，37℃、體積分?jǐn)?shù)6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，隔日半量換液，將收集的培養(yǎng)液分別保存于－20℃冰箱中待測E2。

1.3.6 雌二醇測定

采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定培養(yǎng)液中的E2水平。E2試劑盒購自德國Roche公司，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，數(shù)據(jù)分析采用方差分析和t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 程序冷凍法對卵泡活性的影響

采用膠原酶對人卵巢組織進(jìn)行消化，Calcein AM熒光染色評估各級卵泡的活性。圖1顯示了熒光顯微鏡下熒光染色的竇前卵泡的形態(tài)。人卵巢組織冷凍前后各級卵泡的數(shù)量和構(gòu)成比。冷凍前后的卵泡總數(shù)和始基卵泡數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與新鮮組相比較，程序冷凍組內(nèi)初級卵泡和次級卵泡的數(shù)量及其構(gòu)成比下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，冷凍前后均未觀察到竇狀卵泡，詳見表1。

表1 人卵巢組織中各級卵泡數(shù)量及其構(gòu)成比Tab.1 The number of follicles and their proportions of human ovarian tissues n(%)

圖1 熒光顯微鏡下Calcein AM染色的竇前卵泡Fig.1 Preantral follicles stained with calcein AM under fluorescence microscopy(Bar:50 μm)

2.2 體外培養(yǎng)的人卵巢組織的生長發(fā)育和E2分泌

卵巢組織在體外培養(yǎng)至第4～6天開始出現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，組織逐漸黏附于培養(yǎng)板底面，新鮮培養(yǎng)組貼壁時間(4.5 ±1.0)d，凍融后培養(yǎng)組(4.8 ±0.9)d，2組組織的貼壁時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

體外培養(yǎng)的新鮮卵巢組織和程序凍融后卵巢組織的E2分泌水平詳見表2。結(jié)果顯示，新鮮培養(yǎng)組和程序凍融后培養(yǎng)組的組織都具有分泌E2的功能。圖2顯示了2組的E2水平增長趨勢，2組E2水平增長趨勢一致，隨培養(yǎng)時間延長，E2水平增加，培養(yǎng)開始的6 d內(nèi)E2水平增加緩慢，從第6天至第8天，E2水平增加較迅速，從第8天開始，E2水平增加緩慢，有上下波動。培養(yǎng)第2天，與新鮮培養(yǎng)組相比，凍融后培養(yǎng)組的E2水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。培養(yǎng)第4～6天，凍融后培養(yǎng)組的E2水平偏低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。培養(yǎng)第8～14天，2組的E2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 體外培養(yǎng)的卵巢組織培養(yǎng)液中的雌二醇濃度Tab.2 The level of estradiol in the medium of ovarian tissue cultured in vitro (pg/mL)

圖2 體外培養(yǎng)的卵巢組織培養(yǎng)液中的雌二醇濃度Fig.2 The level of estradiol in the medium of ovarian tissue cultured in vitro

2.3 卵巢組織體外培養(yǎng)對卵泡活性的影響

新鮮卵巢組織和程序凍融后卵巢組織體外培養(yǎng)14 d后，消化染色，各級卵泡的數(shù)量和構(gòu)成比見表1。結(jié)果顯示，與培養(yǎng)前相對應(yīng)組(新鮮組-新鮮培養(yǎng)組，程序冷凍組-凍融后培養(yǎng)組)比較，體外培養(yǎng)后卵泡總數(shù)、始基卵泡和初級卵泡構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。體外培養(yǎng)后次級卵泡數(shù)量及構(gòu)成比增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。新鮮培養(yǎng)組與凍融后培養(yǎng)組組間卵泡總數(shù)和各級卵泡構(gòu)成比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

3 討論

卵巢組織凍存可以同時保存大量卵泡，組織凍存和移植是一種保存女性生殖和內(nèi)分泌功能的新技術(shù)。國外已有卵巢組織冷凍后移植卵巢功能成功恢復(fù)的報道［5-6］，但是，目前對于卵巢組織凍存方法尚有眾多的不確定性因素，這都可能會影響到卵巢組織的活性。國內(nèi)學(xué)者也在此領(lǐng)域做了大量研究［7-8］，然而，國內(nèi)目前尚無成功病例報道，關(guān)鍵問題是凍存技術(shù)不成熟。冷凍前后準(zhǔn)確的卵巢組織質(zhì)量評估也是評價凍存技術(shù)成敗的關(guān)鍵，之前國內(nèi)研究多數(shù)是對卵巢進(jìn)行組織學(xué)檢測，評估冷凍對卵泡的影響，然而組織學(xué)檢測對于卵泡的活性評估有一定限制。本研究使用活細(xì)胞染色劑Calcein AM，直接對有活性的卵泡進(jìn)行熒光染色，分析卵巢組織冷凍對卵泡活性的影響。另外，激素分泌是卵巢組織活性評估的另一方面，并且與卵泡活性相對應(yīng)，兩者相互印證。本研究從卵泡活性和E2分泌兩個方面評估卵巢組織的活性，探討程序化冷凍和體外培養(yǎng)對卵巢組織活性的影響。

冷凍前后卵泡總數(shù)和始基卵泡數(shù)無明顯變化，初級卵泡和次級卵泡的構(gòu)成比差別不顯著，但程序冷凍組的初級卵泡和次級卵泡的構(gòu)成比有下降趨勢。這表明，不同類型的卵泡對程序化冷凍的耐受性可能存在差異。有研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，程序化冷凍法對顆粒細(xì)胞影響較大，體積小、代謝率低、缺乏細(xì)胞器的始基卵泡程序冷凍的效果比較好。Choi等［11］研究發(fā)現(xiàn)，與新鮮組相比，凍融卵巢組織中的顆粒細(xì)胞的分化較低，分離出顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，凍融后的顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D、E，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4等的表達(dá)也有所降低。這說明冷凍過程中，顆粒細(xì)胞受到了損傷。不同細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑的滲透性不一致，在冷凍過程中遭受的損傷也不同。這可能與顆粒細(xì)胞位于卵泡的外層，最早接觸冷凍保護(hù)劑以及感受外界環(huán)境的變化有關(guān)。

初級卵泡和次級卵泡的體積較始基卵泡增大、代謝增強(qiáng)，顆粒細(xì)胞的數(shù)量增多，所以在冷凍過程中，初級卵泡和次級卵泡更易發(fā)生損傷。但是由于用于研究的卵巢組織有限，卵巢組織中次級卵泡的數(shù)量比較少，本研究未發(fā)現(xiàn)冷凍后次級卵泡數(shù)量和構(gòu)成比有顯著下降，尚不能給出次級卵泡比初級卵泡更易發(fā)生損傷的結(jié)論。以上研究結(jié)果表明，始基卵泡對程序冷凍法的耐受性較好，冷凍以后存活率較高且數(shù)量多，對始基卵泡的生長發(fā)育進(jìn)行研究具有廣闊的前景。

E2是卵巢組織分泌的最主要的性激素，其水平可以反映卵巢組織的內(nèi)分泌功能和卵泡的活性。本研究收集體外培養(yǎng)卵巢組織的培養(yǎng)液檢測E2水平，判斷程序化冷凍對卵巢組織內(nèi)分泌功能的影響。研究結(jié)果顯示，新鮮培養(yǎng)組和凍融后培養(yǎng)組均有E2分泌，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，E2水平逐漸增加，這提示卵巢組織在體外培養(yǎng)環(huán)境中能繼續(xù)生長，并保持一定的內(nèi)分泌功能，這為體外培養(yǎng)卵巢組織的臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。在體外培養(yǎng)的第4～6天開始觀察到卵巢組織的貼壁生長現(xiàn)象，這與Li等［12］的研究觀察到的貼壁現(xiàn)象相似。凍融卵巢組織需要相對較長的時間貼壁，但是組間貼壁時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示程序冷凍對卵巢組織體外生長的影響不大。

從折線圖可以觀察到，2組的E2水平增長趨勢一致，隨培養(yǎng)時間延長，E2水平增加，提示卵巢組織在體外培養(yǎng)條件下生長發(fā)育良好。培養(yǎng)的開始階段，凍融組織分泌的E2水平較低，之后逐漸與新鮮培養(yǎng)組接近，培養(yǎng)第8～14天，2組間的E2水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這提示，程序化冷凍對體外培養(yǎng)的卵巢組織的E2分泌無明顯影響，卵巢組織在體外培養(yǎng)初期可能存在一個適應(yīng)階段，特別是對于凍融卵巢組織，可能需要逐漸復(fù)蘇其活性。這也進(jìn)一步說明，程序化冷凍可以較好的保存卵泡的活性，因為是卵巢組織內(nèi)的活性卵泡分泌了E2。

體外培養(yǎng)第6天以后大部分組織已經(jīng)貼壁生長，E2水平增加較迅速。之后在穩(wěn)定的FSH作用下，E2水平增加緩慢，有上下波動，這可能是由于卵巢組織內(nèi)各期卵泡的發(fā)育和閉鎖同時存在，環(huán)境和激素刺激導(dǎo)致了一批卵泡同時閉鎖或凋亡的原因。

本研究中，卵巢組織體外培養(yǎng)14 d以后，卵泡總數(shù)及始基卵泡和初級卵泡構(gòu)成比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，次級卵泡數(shù)量及構(gòu)成比增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。這提示，程序冷凍對卵泡的體外生長發(fā)育能力無顯著影響。卵巢組織體外培養(yǎng)情況下，次級卵泡的生長優(yōu)于始基卵泡和初級卵泡的生長。這與之前Bishonga等［13］的卵泡體外培養(yǎng)研究結(jié)果一致，即大卵泡的發(fā)育潛能優(yōu)于小卵泡。在卵泡生長過程中存在卵泡選擇和優(yōu)勢化現(xiàn)象，即大卵泡抑制其他小卵泡生長發(fā)育而使自己優(yōu)先發(fā)充育成熟的現(xiàn)象，機(jī)制可能是正在成熟的大卵泡分泌E2和抑制素等非激素因子，抑制了較小卵泡的生長。另外，直徑較小的卵泡周圍只有單層顆粒細(xì)胞，而直徑較大的卵泡卵母細(xì)胞周圍圍繞2～4層顆粒細(xì)胞，可較快的實現(xiàn)細(xì)胞貼壁生長，卵泡膜細(xì)胞就可以更早開始增生。

研究［14-15］發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)體系中卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)對竇前卵泡的生長發(fā)育至關(guān)重要，F(xiàn)SH促進(jìn)顆粒細(xì)胞DNA合成。本研究體外培養(yǎng)基中添加了rFSH，次級卵泡卵泡膜細(xì)胞上已經(jīng)有FSH受體，可以接受FSH的刺激作用繼續(xù)發(fā)育，而始基卵泡和初級卵泡缺乏FSH受體，尚不能接受FSH的作用，從而導(dǎo)致不同類型的卵泡在同一生長條件下的生長發(fā)育出現(xiàn)差異。培養(yǎng)至第14天時仍未觀察到有竇狀卵泡，可能由于本研究培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間的限制，本研究培養(yǎng)基中僅有外源性FSH的支持，竇前卵泡的發(fā)育尚受多種其他激素和細(xì)胞因子的影響［16-17］，因此以后對卵泡發(fā)育的影響因素還需繼續(xù)進(jìn)行深入研究。

綜上所述，程序冷凍法可以較好的保存人卵巢皮質(zhì)組織內(nèi)的竇前卵泡，不影響體外培養(yǎng)的卵巢組織的雌二醇分泌。不同類型的卵泡對程序化冷凍的耐受性不同。卵巢組織體外培養(yǎng)情況下，次級卵泡的生長優(yōu)于始基卵泡和初級卵泡的生長。因此，卵巢組織程序化冷凍和體外培養(yǎng)，對女性生殖力保存具有重要意義。

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