夏 穎 殷志爽 石 晨 王 橋 宋學(xué)英

(1.首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，北京100069;2.北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品開發(fā)部，北京100012;3.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京100069)

自由基是人體生命活動(dòng)中多種生物化學(xué)反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物。正常情況下，人體內(nèi)的自由基處于不斷產(chǎn)生和不斷消除的動(dòng)態(tài)平衡中，適量自由基的存在對(duì)維持機(jī)體的正常代謝是必不可少的。但是當(dāng)自由基產(chǎn)生過多或消除過慢時(shí)，體內(nèi)累積過多的自由基會(huì)造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織水平的損傷而誘發(fā)疾?。?－2］。

白芍是一種常用的中藥材，有文獻(xiàn)［3］報(bào)道顯示白芍提取物具有抗氧化清除自由基的活性，但并未確定提取物中抗氧化有效成分。在前期的研究［4］中發(fā)現(xiàn)，白芍中含有一種生物活性成分，五沒食子?；咸烟?pentagalloylglucose，PGG)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 五沒食子?；咸烟堑幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of pentagalloylglucose

PGG分子中含有多個(gè)酚羥基的結(jié)構(gòu)賦予了它一系列獨(dú)特的理化性質(zhì)和生理活性，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提示PGG將可能成為一種天然抗氧化劑而具有潛在的廣泛應(yīng)用前景。

1，1－二苯基 －2－苦基苯肼自由基法(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH)和 Fe3+－三吡啶三吖嗪法(ferric reducing－antioxidant power，F(xiàn)RAP)法是常用的2種檢測(cè)物質(zhì)抗氧化活性方法。

DPPH· 是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基。其作用模式為AH+DPPH→·DPPH·H+A·其中，AH代表自由基清除劑(抗氧化劑)。通過物質(zhì)對(duì)DPPH·自由基的清除情況，可以評(píng)價(jià)其抗氧化能力［5－7］。通?？寡趸芰τ脷埩袈蕘肀硎荆瑲埩袈试叫?，抗氧化能力越強(qiáng)。DPPH·殘留率計(jì)算公式如下:

其中，［DPPH·］REM為 DPPH·殘留率，［DPPH·］T為自由基清除過程中某一時(shí)刻DPPH·的質(zhì)量濃度，［DPPH·］T=0為DPPH的原始質(zhì)量濃度。在一定的濃度范圍內(nèi)，當(dāng)自由基清除劑與DPPH·反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，自由基清除劑的濃度越大，則DPPH·的殘留率越小，即DPPH·的殘留率與自由基清除劑濃度成反比。故測(cè)定不同濃度的自由基清除劑與DPPH·反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)DPPH·的殘留率，即可得到殘留率與清除劑濃度的線性回歸方程。由方程計(jì)算殘留率為50%所對(duì)應(yīng)的清除劑濃度即為清除劑的半抑制濃度IC50。IC50越小，表明清除劑清除自由基抗氧化能力越強(qiáng)。自由基的清除能力(antiradical efficiency，AE)可以用IC50的倒數(shù)來表示AE=1/IC50。根據(jù)AE可以判斷抗氧化劑清除自由基的能力大小，AE越大表示其清除自由基能力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)。DPPH·法測(cè)定簡(jiǎn)便、快速，而且由于DPPH·有較長(zhǎng)的半衰期而使此方法具有良好的重現(xiàn)性，可用于有效地評(píng)價(jià)抗氧化劑的活性，因而此方法被廣泛用于評(píng)價(jià)清除自由基物質(zhì)的抗氧化能力及天然抗氧化劑的篩選。

由Benzie等［8］建立的 FRAP 法是通過 Fe3+－三吡啶三吖嗪［Fe(III)－TPTZ］在酸性溶液中可以被樣品中的還原性物質(zhì)還原成Fe(Ⅱ)呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色，在593nm處具有最大吸收。樣品溶液的吸光度值越大，表明生成Fe(Ⅱ)越多，樣品還原能力越強(qiáng)，故可以用樣品與Fe(III)－TPTZ作用生成Fe(Ⅱ)的多少來評(píng)價(jià)樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱。用FRAP值表示樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱，F(xiàn)RAP在數(shù)值上等于樣品與Fe(III)－TPTZ反應(yīng)后在593nm處的產(chǎn)生的吸光值所相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)FeSO4溶液的濃度(μmol/L)。FRAP值越大，表示樣品抗氧化活性越強(qiáng)［7］，顯示出較強(qiáng)的抗氧化能力，而使機(jī)體內(nèi)免受Fe3+等氧化劑的損傷。該方法原理明確，操作簡(jiǎn)便，易于標(biāo)準(zhǔn)化。FRAP法常用于測(cè)定不同抗氧化物質(zhì)、食物與生物樣品的抗氧化活性。

本文采用高速逆流色譜(high－speed current chromatography，HSCCC)方法，從白芍中提取分離得到其抗氧化有效成分PGG固體粉末。通過DPPH法和FRAP法2種體外抗氧化檢測(cè)方法對(duì)白芍提取物及其有效成分PGG的抗氧化活性進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

2695型高效液相色譜系統(tǒng)(包含四元梯度泵、2996型二極管陣列紫外檢測(cè)器、empower色譜工作站，美國(guó)Waters公司);液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(包含Quattro microTMAPI質(zhì)譜、2695型四元梯度泵、2487型紫外檢測(cè)器、氦氣脫氣機(jī)、Masslynx 4.0質(zhì)譜工作站，美國(guó)Waters公司);HSCCC－TBE 300A型高速逆流色譜儀(包含8823B型紫外檢測(cè)器、TBP－50A型泵，上海同田生化技術(shù)有限公司);UV－2550型紫外分光光度計(jì)(日本 SHIMADZU公司);真空干燥儀(美國(guó)Labconco公司)。

白芍(產(chǎn)地安徽亳州)購(gòu)自北京同仁堂藥店;PGG(純度＞98%)購(gòu)自中山康之源生物科技有限公司;三吡啶三吖嗪(2，4，6－tripyridyl－s－triazine，TPTZ;Alfa Aesar，德國(guó))，DPPH·，Alfa Aesar，德國(guó))，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司德國(guó))，維生素C(Vitamin C，Vc;北京化工廠)，其他試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白芍粗提物的制備及PGG的分離純化

采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的HSCCC方法從白芍中分離純化PGG［9］，即將白芍粉碎后用50%乙醇－水溶液超聲提取，將提取液減壓旋干后用水溶解，用乙酸乙酯萃取，將萃取液減壓旋干得到白芍粗提物。然后，將粗提物用HSCCC方法進(jìn)行分離純化，主機(jī)轉(zhuǎn)速為800 r/min，流動(dòng)相的流速為2.0 mL/min，洗脫方式為從頭至尾的方式，用紫外檢測(cè)器在280 nm處在線監(jiān)控。先采用一種溶劑體系(正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水，0.5 ∶5∶1 ∶5)進(jìn)行洗脫，根據(jù) HSCCC 譜圖收集含有目標(biāo)化合物PGG的吸收峰的洗脫液，減壓旋干得到初分物。然后，再用另一種溶劑體系(正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水，0.5∶5∶0.5∶5)將初分物用HSCCC進(jìn)一步分離，根據(jù)HSCCC譜圖收集PGG的吸收峰，減壓旋干得到棕色PGG粉末。PGG的檢測(cè)分析方法采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的HPLC方法進(jìn)行［10］。

1.2.2 白芍粗提物及PGG清除DPPH·活性的測(cè)定

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取DPPH· 2.5 mg，用乙醇配制成質(zhì)量濃度為25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取 0、2.0、4.0、6.0、8.0 和 10.0 mL，用乙醇定容到10 mL，配制 DPPH·質(zhì)量濃度分別為 0、5、10、15、20和25 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以乙醇為空白，測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以DPPH·濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為 y=0.0319x+0.040，r2=0.9994。

2)DPPH·清除率的測(cè)定:選用Vc作為陽(yáng)性對(duì)照藥，用乙醇為溶劑，分別將白芍粗提物、PGG和Vc配成一系列待測(cè)溶液(濃度分別為 0、25、50、100 μg/mL)。分別取上述各溶液0.10 mL，加入質(zhì)量濃度為25 μg/mL的DPPH·標(biāo)準(zhǔn)液3.90 mL，搖勻混合液。以乙醇為空白，用紫外－可見分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)定其在不同時(shí)間的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成相應(yīng)的DPPH· 的質(zhì)量濃度，計(jì)算DPPH· 殘留率。以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，DPPH· 殘留率為縱坐標(biāo)繪制白芍粗提物、PGG及Vc清除DPPH·的曲線，得到不同濃度樣品的殘留率隨時(shí)間變化的曲線。

1.2.3 用FRAP法測(cè)定白芍粗提物及PGG的抗氧化活性

1)FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:參照Benzie等［8］的方法并進(jìn)行了進(jìn)一步修改。按照體積比為10∶1∶1的比例，精確量取醋酸鈉緩沖液(0.3 mol/L，pH3.6)、TPTZ溶液(10 mmol/L)及標(biāo)準(zhǔn)FeSO4溶液，混勻，即得 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(濃度分別為10、25、100、150、200、400、500 μmol/L)。

分別取4.0 mL各FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，在37℃反應(yīng)30 min，然后測(cè)定溶液在593nm處吸光度。以FeSO4濃度為縱坐標(biāo)(表示為FRAP值)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為 y=524.67x－2.0301，r2=0.999 9。

2)抗氧化活性(FRAP值)的測(cè)定:TPTZ工作液的配制:TPTZ工作液由0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)，10 mmol/L TPTZ 溶液和 20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液組成，三者按體積比為10∶1∶1混合而成。TPTZ工作液需要現(xiàn)用現(xiàn)配［8］。

用乙醇為溶劑，分別將白芍粗提物、PGG和Vc配制成一系列待測(cè)溶液(濃度分別為10、25、50和100 μg/mL)，分別取0.20 mL各濃度的待測(cè)溶液，加入3.80 mL新鮮配制的TPTZ工作液，混勻。在37℃反應(yīng)30 min后，測(cè)定波長(zhǎng)為593 nm處吸光度。每份溶液平行操作3次，取平均值。依據(jù)FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各溶液的抗氧化活性(FRAP值)。

2 結(jié)果

2.1 白芍粗提物經(jīng)HSCCC分離純化得到PGG

將白芍粉碎經(jīng)乙醇提取得到粗提物，通過HSCCC分離純化得到棕色PGG固體粉末，經(jīng)HPLC檢測(cè)該固體粉末為單一組分(圖2A)，用歸一化法測(cè)定其純度為95.7%;將其HPLC譜圖與對(duì)照品PGG的HPLC譜圖比較，表明該化合物為PGG;用ESI－MS檢測(cè)其質(zhì)荷比m/z為939.5(圖2B)，其相對(duì)分子量與PGG分子式C41H32O26吻合，進(jìn)一步證明該化合物為PGG。

圖2 PGG的HPLC譜圖(A)和質(zhì)譜圖(B)Fig.2 HPLC chromatogram(A)and ESI-MS spectrum(B)of the PGG extracted from Radix Paeoniae Alba

2.2 清除DPPH·活性的研究

2.2.1 PGG和白芍粗提物清除DPPH·能力大于Vc

從白芍粗提物、PGG及Vc清除DPPH·的殘留率曲線圖(圖3)可以看到，在相同濃度下，白芍粗提物及PGG均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH·自由基的能力，DPPH·殘留率明顯低于同濃度Vc，說明白芍粗提物及PGG的抗氧化效果良好，其活性超過陽(yáng)性對(duì)照Vc。

圖3 PGG(A)、白芍粗提物(B)及Vc(C)DPPH·殘留率Fig.3 DPPH· residual rates of PGG(A)，crude extract from Radix Paeoniae(B)and Vc(C)

圖3顯示，隨著抗氧化物質(zhì)濃度的增大，DPPH·殘留率逐漸降低，清除DPPH·自由基的作用增強(qiáng)。表明抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力隨濃度增大而增強(qiáng)，即白芍粗提物及PGG清除DPPH·的作用呈一定的量－效關(guān)系。當(dāng)反應(yīng)到30 min時(shí)，各樣品溶液基本達(dá)到平衡。在PGG、白芍粗提物及Vc濃度同為100 μg/mL時(shí)，DPPH·殘留率分別為27.2%、33.8%、52.7%，即PGG＜白芍粗提物＜Vc。這說明抗氧化能力PGG＞白芍粗提物＞Vc。

此外，從圖3還可見以看到，在DPPH·溶液中加入Vc溶液后，開始DPPH·殘留率迅速下降，但在5 min左右即達(dá)到穩(wěn)定，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)DPPH·殘留率幾乎不再發(fā)生變化，也就是說，5 min以后Vc不再使DPPH·減少;而PGG和白芍粗提物可以維持較長(zhǎng)的時(shí)間清除DPPH·直到約30 min殘留率才達(dá)到穩(wěn)定。

2.2.2 白芍粗提物及PGG與Vc清除能力的比較

由圖 3可知，當(dāng)白芍粗提物、PGG和 Vc與DPPH·反應(yīng)30 min時(shí)，各反應(yīng)體系基本達(dá)到平衡狀態(tài)。分別計(jì)算各溶液在與DPPH·反應(yīng)30 min(即平衡)時(shí)DPPH·的殘留率，以殘留率y對(duì)濃度x做線性回歸，計(jì)算IC50和AE(表1)。

表1 白芍粗提物和PGG對(duì)DPPH·的清除能力Tab.1 Antiradical efficiency of scavenging DPPH·of the samples

表1給出DPPH·殘留率y與樣品濃度x關(guān)系的線性回歸方程、半抑制濃度IC50和自由基清除能力AE。由表1可以看出，清除DPPH·能力AE的大小順序?yàn)镻GG＞白芍粗提物＞Vc，且PGG的IC50不足Vc的1/2，提示PGG的抗氧化能力高于Vc，將可能成為一種潛在的高效抗氧化劑。

2.3 樣品抗氧化/能力檢測(cè)

FRAP值可以表示樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱，白芍粗提物、PGG和Vc在不同濃度下的FRAP值詳見表2。

表2 不同濃度下白芍粗提物、PGG的FRAP值Tab.2 RAP values of the samples in the different concentrations(μg/mL)

從表2可以看到:①對(duì)于同一物質(zhì)(如PGG、白芍粗提物或Vc)，隨著樣品濃度的增大，溶液FRAP值增大，說明其抗氧化活性隨著樣品濃度的增大而增加。②在同一樣品濃度下，PGG的FRAP值最大，抗氧化能力最強(qiáng);其次是白芍粗提物，其FRAP值也大于Vc。這說明PGG和白芍粗提物的抗氧化活性均高于陽(yáng)性對(duì)照Vc，抗氧化能力順序?yàn)镻GG＞白芍粗提物＞Vc。③當(dāng)樣品濃度較低(如 10 μg/mL)時(shí)，Vc的FRAP遠(yuǎn)小于PGG和白芍粗提物，可是隨著樣品濃度的增大，各物質(zhì)抗氧化能力均有所增強(qiáng)，而Vc抗氧化能力增加得更為顯著。當(dāng)濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，Vc的FRAP已經(jīng)達(dá)到420.8 μmol/L，接近白芍粗提物(421.3 μmol/L)，但 PGG的抗氧化能力仍最強(qiáng)(FRAP值為576.1 μmol/L)，即在樣品濃度為100 μg/mL時(shí)，抗氧化能力為PGG＞白芍粗提物≈Vc。

3 討論

通過DPPH法和FRAP法兩種檢測(cè)體系，研究白芍粗提物及其有效成分PGG的抗氧化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照Vc相比，白芍粗提物和PGG均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且在一定的范圍內(nèi)，濃度越大抗氧化能力越強(qiáng)，其抗氧化作用與濃度呈量效關(guān)系。在DPPH·清除實(shí)驗(yàn)中，白芍粗提物和PGG均顯示了良好的清除自由基的能力，在濃度為10～100 μg/mL范圍內(nèi)，其抗氧化活性均高于Vc;在FRAP抗氧化實(shí)驗(yàn)中，白芍粗提物和PGG同樣顯示了較強(qiáng)的抗氧化能力，但FRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果與DPPH法所得結(jié)果稍有差別的是當(dāng)樣品濃度較大時(shí)(如100 μg/mL時(shí))，Vc的抗氧化活性接近白芍粗提物，但仍低于PGG。

總之，本實(shí)驗(yàn)對(duì)白芍粗提物及其有效成分PGG的抗氧化作用的研究結(jié)果表明，在中藥白芍中含有抗氧化有效成分PGG。與陽(yáng)性對(duì)照Vc相比，白芍粗提物和PGG具有較強(qiáng)的清除自由基及抗氧化活性，且PGG的抗氧化作用遠(yuǎn)大于陽(yáng)性對(duì)照藥Vc。研究結(jié)果提示PGG將有可能成為一種潛在的天然高效低毒的抗氧化劑廣泛地應(yīng)用于臨床。

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