孫越鵬，耿 磊，李長(zhǎng)福，范 芳

(1.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300462;2.天津藥業(yè)研究院有限公司，天津 300000；3.遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

SiRNA沉默HBx表達(dá)對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞增殖和凋亡的影響

孫越鵬1，耿 磊2，李長(zhǎng)福3，范 芳3

(1.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300462;2.天津藥業(yè)研究院有限公司，天津 300000；3.遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的觀察沉默HB x基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2.2.15增殖和凋亡的影響。方法用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pSIHBV/X轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2.2.15，RT-PCR法檢測(cè)HBx mRNA表達(dá)；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中HBsAb和HBeAg的表達(dá)情況；MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響；AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果pSIHBV/X質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后HBx mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；G2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pSIHBV/X質(zhì)粒后HepG2.2.15細(xì)胞的增殖受到抑制，AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示HBx siRNA可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論靶向HBx基因的干擾質(zhì)粒能降低HepG2.2.15細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的水平、抑制HepG2.2.15細(xì)胞增殖，促進(jìn)HepG2.2.15細(xì)胞凋亡。

RNA干擾；HBx基因；HepG2.2.15細(xì)胞；增殖；凋亡

肝細(xì)胞癌( hepatocellular carcinoma， HCC) 是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生是一個(gè)多階段的病理學(xué)過程。我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，絕大部分肝癌患者存在過乙型肝炎病毒( heptis B virus，HBV)的感染，HBV是HCC的致病因子已得到公認(rèn)，HBV x基因編碼的HBV X蛋白與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，可通過反式激活作用干擾宿主細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及凋亡[1-2]。HepG2.2.15細(xì)胞是含有HBV基因的肝癌細(xì)胞，是研究HBV的細(xì)胞模型系統(tǒng)[3]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默HBx基因，觀察抑制HBx基因表達(dá)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15購自博慧斯生物技術(shù)公司；pSIHBV/X與對(duì)照質(zhì)粒pTZU+1由瀘州醫(yī)學(xué)院張建軍教授惠贈(zèng)；質(zhì)粒擴(kuò)增菌種DH5α、內(nèi)切酶等購于寶生物有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國(guó)GIBCO產(chǎn)品；胎牛血清購于Hyclone公司；Lipofectamine2000為Invetrogen公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒購自華美生物工程公司；AnnexinV-FITC/PI雙染試劑購自與Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)共分4組：以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照組(control group)；僅加脂質(zhì)體的細(xì)胞作為脂質(zhì)體組(LipofectamineTM2000 group)；以轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒細(xì)胞作為質(zhì)粒對(duì)照組(control plasmid group)；以轉(zhuǎn)染pSIHBV/X質(zhì)粒細(xì)胞作為pSIHBV/X實(shí)驗(yàn)組(pSIHBV/X group)。利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pTZU+1與pSIHBV/X質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞(操作步驟同說明書)：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待細(xì)胞融合度為80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

1.3 RT-PCR檢測(cè)HBx基因的表達(dá) RT-PCR分析轉(zhuǎn)染后24 h各組細(xì)胞HBx基因的表達(dá)情況，使用HBx引物為：上游5′-TCATCGCCAGCATCATCAAAC-3′，下游3′-ATGTACGGCTGGAGGTCTGTCA-5′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為463 bp。用RNA抽提試劑盒分別提取每組細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書進(jìn)行RT反應(yīng)，以10 μL RT產(chǎn)物為模板，分別擴(kuò)增β-actin和HBx基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，將結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描灰度值，以各組目的基因與內(nèi)參的灰度比值作為相對(duì)表達(dá)量，比較各組之間的差異。

1.4 ELISA法檢測(cè)HBsAb和HBeAg的表達(dá) 將pSIHBV/X質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞培養(yǎng)液，采用HBsAb和HBeAg診斷試劑盒及ELISA方法檢測(cè)HBsAb和HBeAg的表達(dá)情況，計(jì)算抑制率。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/空白對(duì)照孔OD值)×100%。

1.5 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種1×104個(gè)。培養(yǎng)12 h后，洗掉培養(yǎng)液，換1%胎牛血清的低血清培養(yǎng)基同步化12 h。依實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。時(shí)間到后，洗掉培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基100 μL，、50 μLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后細(xì)胞增殖情況。

1.6 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液接種于鋪有蓋玻片的24孔板中，每孔接種2×104個(gè)。培養(yǎng)12 h后，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取800 μL的Binding Buffer加入8 μL AnnexinV-FITC和8 μL Propidium Iodide(PI)，避光，室溫反應(yīng)5 min。高倍鏡下隨即取5個(gè)視野，在熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)算平均凋亡指數(shù)(凋亡指數(shù) = 每高倍視野凋亡細(xì)胞數(shù)/每高倍視野細(xì)胞總數(shù)×100 %)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pSIHBV/X酶切、測(cè)序

2.1.1 質(zhì)粒pSIHBV/X酶切結(jié)果 pSIHBV/X為氨芐抗性質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α后，對(duì)從陽性菌落中擴(kuò)增提取的質(zhì)粒pSIHBV/X進(jìn)行酶切，1和2泳道顯示pSIHBV/ X表達(dá)載體未被酶切和經(jīng)Sal Ⅰ酶切后，大小基本相等，泳道3顯示經(jīng)Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切后重組體質(zhì)粒產(chǎn)生2800bp、395 bp 左右的兩個(gè)條帶，泳道4經(jīng)Xba Ⅰ酶切成約3100bp 的DNA 片段，證實(shí)重組表達(dá)質(zhì)粒pSIHBV/ X構(gòu)建正確(見圖1)。

注：M:DL5000 marker;1：pSIHBV/X表達(dá)載體未被酶切;2: pSIHBV/ X表達(dá)載體經(jīng)Sal Ⅰ酶切;3：pSIHBV/ X表達(dá)載體經(jīng)Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切;4：pSIHBV/ X表達(dá)載體經(jīng)Xba Ⅰ酶切質(zhì)粒pSIHBV/X測(cè)序結(jié)果。 圖1 質(zhì)粒pSIHBV/X酶切鑒定

2.1.2 質(zhì)粒pSIHBV/X測(cè)序結(jié)果 將質(zhì)粒送到生工測(cè)序，引物為U6啟動(dòng)子的通用引物，測(cè)序結(jié)果顯示siRNA的表達(dá)模板5′-TCGAGGAACCAACAAGAAGATGAGTTCGCTCATCTTCTTGTTGGTTCT

TTTT-3′成功插入了載體中。證實(shí)特異表達(dá)載體pSIHBV/X構(gòu)建正確。pSIHBV/X質(zhì)粒插入測(cè)序結(jié)果(下劃線為小干擾RNA的作用靶點(diǎn))：GCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCGA

GGAACCAACAAGAAGATGAGTTCGCTCATCTTCT

TGTTGGTTCTTTTTCTAGAGCGGACTTCGGTC.

2.2 RT-PCR檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞HBx基因的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果(見圖2、表1)，pSIHBV/X組HBx表達(dá)量低于其它各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，抑制率為53.6%。而其它各組表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：1：空白對(duì)照組 2：脂質(zhì)體組3：空載體組4：pSIHBV/X組。 圖2 HBx基因在HepG2.2.15細(xì)胞中24h的表達(dá)

表1 HBx在HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)(24 h)

組別HBx/β-actin(x±s)空白對(duì)照組1．615±0．148脂質(zhì)體組1．543±0．134pTZU+1空載體組1．669±0．108pSIHBV/X實(shí)驗(yàn)組0．750±0．075??

注：**：與空白對(duì)照組比較，P<0.01。

2.3 pSIHBV/對(duì)各組細(xì)胞中HBsAb和HBeAg的抑制作用 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示(見表2，表3)：在轉(zhuǎn)染24 h和48 h后pSIHBV/ X 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg 和HBeAg 的表達(dá)量都有明顯下降(P<0.01), 空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、空載體組差異無顯著性(P>0.05)。

組別OD450(x±s)24h48h空白對(duì)照組0．875±0．0791．550±0．185脂質(zhì)體組0．861±0．2241．701±0．076pTZU+1空載體組0．842±0．0271．635±0．145pSIHBV/X實(shí)驗(yàn)組0．466±0．011??0．630±0．877??

注：**：與空白對(duì)照組比較，P<0.01。

組別OD450(x±s)24h48h空白對(duì)照組0．218±0．1250．365±0．128脂質(zhì)體組0．244±0．0590．447±0．119pTZU+1空載體組0．208±0．0420．341±0．157pSIHBV/X實(shí)驗(yàn)組0．134±0．011??0．217±0．025??

注：**：與空白對(duì)照組比較，P<0.01。

2.4 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖 MTT法結(jié)果顯示：空白組24 h、48 h、72 h OD490的吸收值分別為0.436±0.027、0.731±0.017、1.105±0.051，而pSIHBV/X組24 h、48 h、72 h OD490的吸收值分別為0.388±0.087*、0.623±0.016*、0.997±0.036*(P<0.05)。從圖3可看出pSIHBV/X組在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h都對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，且48 h抑制效果最明顯。

圖3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況

2.5 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 pSIHBV/X組在24h和48h細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于其它各組，凋亡率分別為25.66%和34.14%(P< 0. 01)?？瞻讓?duì)照組、脂質(zhì)體組、pSIHBV/X組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

表4各組24 h和48 h細(xì)胞凋亡指數(shù)

組別總視野數(shù)24h凋亡指數(shù)(x±s)48h凋亡指數(shù)(x±s)空白對(duì)照組517．13%±0．19%24．09%±1．22%脂質(zhì)體組519．60%±0．27%25．06%±1．03%pTZU+1空載體組519．32%±4．47%25．65%±0．12%pSIHBV/X實(shí)驗(yàn)組525．66%±1．86%?34．14%±1．05%?

注：*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

乙肝病毒的感染是肝臟疾病(包括肝炎，肝硬化和肝癌)發(fā)生的主要原因，[4]。HBV x基因是HBV病毒基因組中最小的開放性讀碼框，是HBV復(fù)制的關(guān)鍵性基因，HBx蛋白在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖及凋亡中均具有很強(qiáng)的活性，研究發(fā)現(xiàn) HBx蛋白在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起了非常重要的作用[5-6]。

HBx基因可通過激活癌基因與細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化。將HBx基因?qū)胄∈蟪衫w維細(xì)胞NIH3T3中，然后用地塞米松誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞DNA合成增加、細(xì)胞周期進(jìn)程加快。研究發(fā)現(xiàn)，HBx基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)力旺盛、分裂相多見，克隆形成率高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞。對(duì)肝癌細(xì)胞周期的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，HBx基因轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞，其G0/G1期細(xì)胞比空載體組和未轉(zhuǎn)染組減少而進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增高，提示HBx基因轉(zhuǎn)染加快了肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，使肝癌細(xì)胞惡性程度增高[7-10]。

HepG2.2.15細(xì)胞被廣泛用于HBV病毒的檢測(cè)試驗(yàn)，為了研究pSIHBV/X表達(dá)載體能否有效的抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)，進(jìn)一步的證實(shí)抑制效應(yīng)，本研究檢測(cè)了pSIHBV/X對(duì)細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pSIHBV/X干擾質(zhì)粒于HepG2.2.15細(xì)胞沉默HBx基因后HBx mRNA水平表達(dá)顯著降低，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg 和HBeAg 的表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯下降(P<0.01)。pSIHBV/X對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，抑制率明顯高于空白對(duì)照組、空載體組、脂質(zhì)體組(P<0.01)。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染后48h抑制效果最佳，72 h抑制效率下降，其可能原因是siRNA的表達(dá)載體隨著細(xì)胞的快速分裂而不斷的丟失，從而降低了干擾效率。

目前關(guān)于HBx引發(fā)的凋亡信號(hào)通路越來越受到研究者的關(guān)注，但無統(tǒng)一的定論。許多研究已表明，HBX蛋白對(duì)細(xì)胞的凋亡有著雙層作用。一方面，HBX蛋白可以阻斷凋亡，另一方面卻起著促凋亡作用。HBX蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的雙層作用顯示了x基因的表達(dá)及其在病毒發(fā)病原理中的生理作用是復(fù)雜多樣的，而且可能是緊緊相互協(xié)調(diào)的。HBx可通過抑制p53的表達(dá)、提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、促進(jìn)survivin的表達(dá)等抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。BcL-2為抑凋亡蛋白，Bax為促凋亡蛋白。研究發(fā)現(xiàn)HBx均能使上述基因高表達(dá)，從而證實(shí)了HBx既能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡又能抑制細(xì)胞的凋亡[11-12]。HBx還能通過抑制線粒體膜去極化抑制凋亡[13]。HBx還可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)磷酸化Raf-1的ser338/339和Tyr340/341位點(diǎn)，激活Raf-1移位至線粒體使細(xì)胞免受應(yīng)激所引起的凋亡[14-15]。c-myc癌基因既能促進(jìn)細(xì)胞增殖能力又能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡能力，c-myc所在HBx瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)量相比較，前者要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者[16]。提示了急性感染HBx的HepG2細(xì)胞對(duì)增殖和凋亡更加敏感。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HBx siRNA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用。原因可能是實(shí)驗(yàn)所用肝癌細(xì)胞中更多的啟動(dòng)了凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。目前為止，HBV感染對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用和確切機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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[收稿2013-05-02;修回2013-06-10]

(編輯：譚秀榮)

TheeffectsofsilencingofHBxgeneexpressionbysiRNAontheproliferationandapoptosisofHepG2.2.15cells

Sunyuepeng1,Genglei2,Lichangfu3,Fanfang3

(1.Tianjin Vocational College of Bioengineering, Tianjin 300462,China;2.Tianjin Pharmaceutical Research Institute Company Limited，Tianjin 300000,China；3.Department of Biochemistry,Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveObserve the effects of silencing HBx gene expression on the proliferation and apoptosis of HepG2.2.15 cells.MethodspSIHBV/X siRNA interference vectors were transfected into HepG2.2.15 cells．The HBx mRNA expression was measured using RT- PCR. The levels of HBsAg and HBeAg in cell supernatant were determined by ELISA. The cell proliferation was evaluated by MTT. The cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining method.ResultsAfter transfection of the pSIHBV/X siRNA vectors，HBx mRNA expression was inhibited compared with control group(P<0.01)；The levels of both HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell supernatants were significantly decreased after the transfection of pSIHBV/X, compared with the control group (P<0.01). The cell proliferation was inhibited and the cell apoptosis was promoted after the transfection of pSIHBV/X, compared with the control group (P<0.01).ConclusionOur results display that HBx gene RNA interference resulted in the reduction of the levels of HBsAg and HBeAg, the inhibition of cell proliferation and the increase of cell apoptosis in HepG2.2.15 cells.

RNA interference; HBx gene; HepG2.2.15；proliferation; apoptosis

R735.7

A

1000-2715(2013)04-0301-05

遵義醫(yī)學(xué)院碩士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO:2004018)。

范芳,女,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，E-mail:fanf1970@126.com。