胡 奎，王 凡，江 慧，陳 然，李 黎，方 洋，李俊凱 (長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

不同前處理方法測(cè)定小飛蓬植株中莽草酸含量比較

胡 奎，王 凡，江 慧，陳 然，李 黎，方 洋，李俊凱 (長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

施用草甘膦后雜草體內(nèi)莽草酸的含量可作為檢測(cè)雜草對(duì)草甘膦抗性水平的重要指標(biāo)，但樣品的前處理方法對(duì)測(cè)定結(jié)果具有一定的影響。以小飛蓬(ConyzaCanadensisL.Crong)為材料，設(shè)計(jì)了液氮速凍干燥研磨、常溫勻漿和高溫(120℃)殺青后真空干燥研磨3種樣品前處理方法處理小飛蓬樣品，用鹽酸提取莽草酸，經(jīng)高碘酸、氫氧化鈉、甘氨酸顯色，在380nm下測(cè)定光密度。3種前處理方法平行30次測(cè)定莽草酸含量平均值分別為563.3507、462.8153、888.1420μg/g，在5%水平上，3種處理具有顯著差異。各處理標(biāo)準(zhǔn)誤的大小分別為13.7343、23.7483、30.1076。液氮速凍干燥研磨前處理方法測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)誤小，準(zhǔn)確度高，可作為莽草酸法檢測(cè)雜草對(duì)草甘膦抗性水平中推薦的樣品前處理方法。

草甘膦；莽草酸；小飛蓬(ConyzaCanadensisL.Crong)；抗性

小飛蓬(ConyzaCanadensisL.Crong)為菊科飛蓬屬越年生或一年生草本植物，又稱祁州一支蒿、蛇舌草、竹葉艾、苦蒿等，原產(chǎn)于北美洲，現(xiàn)已遍布全球溫帶地區(qū)，入侵我國后在各地均有分布，是我國分布最廣的入侵物種之一。2005年，宋小玲等[1]在我國浙江寧波發(fā)現(xiàn)抗草甘膦的小飛蓬。隨著抗草甘膦作物的推廣，草甘膦用量逐漸增加，但由于抗草甘膦雜草的出現(xiàn)和抗性日益嚴(yán)重，給草甘膦的應(yīng)用帶來了巨大挑戰(zhàn)，雜草對(duì)草甘膦的抗性監(jiān)測(cè)成為科學(xué)應(yīng)用草甘膦的關(guān)鍵之一。草甘膦競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸途徑的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase，簡(jiǎn)稱EPSP)的活性[2]，EPSP是植物和微生物體內(nèi)芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化由莽草酸-3-磷酸酷和磷酸烯醇式丙酮酸形成5-烯醇式丙酮酸基-莽草酸-3-磷酸酯的反應(yīng)。當(dāng)EPSP受到抑制時(shí)，此反應(yīng)便被切斷，導(dǎo)致EPSPS脫磷酸化底物莽草酸的大量積累[3-4]。

目前，測(cè)定雜草對(duì)草甘膦抗性的方法中莽草酸法主要依據(jù)草甘膦處理植株后，引起敏感植株體內(nèi)莽草酸大量積累，而抗草甘膦雜草體內(nèi)莽草酸的積累量則明顯低于敏感植株[5]。施用草甘膦后雜草體內(nèi)莽草酸的含量可作為檢測(cè)雜草對(duì)草甘膦抗性水平的重要指標(biāo)[6]。在測(cè)定過程中，樣品的前處理方法與測(cè)定結(jié)果關(guān)系密切，本研究通過設(shè)計(jì)不同前處理方法，進(jìn)行小飛蓬植株中莽草酸含量的測(cè)定，以為建立雜草對(duì)草甘膦抗性監(jiān)測(cè)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

小飛蓬植株采自湖北省荊州市荊州區(qū)松柏村；主要儀器有紫外可見分光光度計(jì)、冷凍干燥機(jī)、低溫離心機(jī)、烘箱、超聲波洗凈儀；藥劑莽草酸(標(biāo)樣)、高碘酸、氫氧化鈉、鹽酸、甘氨酸等均為市售分析純。

表1 各處理小飛蓬體內(nèi)莽草酸含量測(cè)定結(jié)果 μg/g

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品準(zhǔn)備

采集12葉期左右長(zhǎng)勢(shì)一致的小飛蓬植株頂端部分，置于預(yù)先準(zhǔn)備好的碎冰中帶回實(shí)驗(yàn)室，剪取小飛蓬葉片于托盤內(nèi)，并充分混勻。用千分之一的天平準(zhǔn)確稱取90份小飛蓬樣品，每份0.5g。

1.2.2 樣品處理

液氮處理：取30份樣品，直接加液氮速凍，研磨至粉末狀。

常溫勻漿：另取30份樣品，在常溫下研磨勻漿。

高溫殺青處理：將30份樣品置于預(yù)先升溫至120℃的烘干箱內(nèi)10min，取出樣品，并放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)真空干燥，約3h后取出研磨至粉末狀。

1.2.3 莽草酸的提取及含量測(cè)定

參照Gaitonde等[7]、婁遠(yuǎn)來等[8]的方法，將1.2.2中各處理的所有樣品轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入1ml 0.25mol/L HCl輕輕震勻，浸提1h后超聲波輔助提取15min。4℃離心(12000r/min，15min)，上清液置4℃保存待測(cè)。

稱取莽草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0100g溶于1ml 0.25 mol/L HCl中，分別取0、2、5、10、25、40、50μl于試管中，加0.25mol/L HCl至1ml，加1%高碘酸2ml混合搖勻后，放置室溫下反應(yīng)，3h后加入2ml氫氧化鈉和1.2ml 0.1mol/L甘氨酸分次搖勻后，在380nm處測(cè)量并記錄光密度值，通過回歸分析建立莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

取待測(cè)樣品上清液50μl，按上述相同步驟測(cè)光密度，并換算成莽草酸含量。

2 結(jié)果與分析

將用紫外可見分光光度計(jì)在380nm處測(cè)定各樣品的光密度值，換算成相應(yīng)的莽草酸含量，結(jié)果見表1。不同處理小飛蓬體內(nèi)莽草酸含量測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤分析見表2。結(jié)果顯示，液氮處理組的標(biāo)準(zhǔn)誤最小，而高溫殺青處理組的標(biāo)準(zhǔn)誤最大，在5%水平上，各處理間差異顯著，1%水平上，高溫殺青處理組與其它兩個(gè)處理差異極顯著。

表2 不同前處理方法測(cè)定莽草酸含量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)誤分析表

3 討論與小結(jié)

本研究中，液氮處理組標(biāo)準(zhǔn)誤小，可能是液氮速凍降低了植株體內(nèi)相關(guān)酶的活性，保證了各物質(zhì)的含量相對(duì)穩(wěn)定。高溫殺青處理組的測(cè)定結(jié)果偏高，可能是高溫導(dǎo)致莽草酸的下游化合物烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸分解，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果顯著高于其他處理。但具體是什么原因?qū)е聹y(cè)定結(jié)果偏高，還需要進(jìn)一步研究。

3種前處理方法中，液氮處理后進(jìn)行研磨提取測(cè)定小飛蓬植株中莽草酸含量，標(biāo)準(zhǔn)誤最小，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可作為莽草酸法檢測(cè)雜草對(duì)草甘膦抗性水平方法中推薦的樣品前處理方法。

[1]SONG X L，WU J J，QIANG S.Establishment of a Test Method of Glyphosate-resistantConyzaCanadensisin China[A].The 20th Asian-Pacific Weed Science Society Conference[C].Ho Chi Ming City：Agriculture Publishing House，2005：499-504.

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[7]Gaitonde M K，Gordon M W.A microchemical method for the detection and determination of shikimic acid[J].Journal of Biological Chemistry，1958，230：1043-1050.

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2013-06-10

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303031);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30971948)。

胡 奎(1989-)，男，碩士生，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥學(xué)。

[作者簡(jiǎn)介]李俊凱，E-mail:junkaili@sina.com。

S481+.4

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1673-1409(2013)23-0007-03