膠束毛細(xì)管電泳-二極管陣列快速分離和檢測(cè)5種“瘦肉精”類藥物

(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京100049)

1 引 言

當(dāng)前，食品安全問(wèn)題日益突出，在眾多食品污染物中，“瘦肉精”倍受關(guān)注。“瘦肉精”泛指能降低脂肪、提高瘦肉率的一類藥物，通常屬于β-興奮劑(β-Agonists)，又叫β-激動(dòng)劑或β-受體激動(dòng)劑，全稱β-腎上腺素能興奮劑(β-Adrenergic Agonist)?？藗愄亓_(又稱克喘素、雙氯醇胺或苯甲醇胺)、萊克多巴胺、沙丁胺醇(又稱舒喘寧)、西馬特羅(又稱息喘寧)、特布他林是5種最常見的“瘦肉精”(見表1)。

“瘦肉精”可提高家禽和牲畜肌肉的生成速度[1]，用于促生長(zhǎng)目的時(shí)劑量一般都超過(guò) 5 μg/g，當(dāng)添加到飼料中的藥量超過(guò)此劑量時(shí)，就達(dá)到“同化劑量”。該類藥物易在畜禽體內(nèi)尤其是肝臟組織中蓄積，當(dāng)人體中累計(jì)攝入劑量超過(guò)一定值或一次食入高殘留量(>0.1 μg/g)的內(nèi)臟組織如肝、腎、肺時(shí)，易導(dǎo)致β-興奮劑毒副作用，出現(xiàn)頭暈、心悸、手指震顫等中毒癥狀，此類藥物造成的威脅已成為重大的食品安全問(wèn)題。許多國(guó)家和地區(qū)都明令禁止在畜牧業(yè)中使用“瘦肉精”，以保證消費(fèi)者的權(quán)利和安全。在我國(guó)，禁止使用任何類型“瘦肉精”。又因該類藥物用于人體可以降低體重和增加骨骼肌肉力量[2]，加之其促蛋白同化作用及可以興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，被非法用于體育運(yùn)動(dòng)中，已被世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(WADA)列為禁藥。

1.1 鹽酸克倫特羅

“瘦肉精”中影響最廣的是鹽酸克倫特羅 (Clenbuterol, CLB)，又稱“克侖特羅”，化學(xué)名為“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3,5二氯苯甲醇鹽酸鹽”，可舒張支氣管、改善通氣、舒張和松弛子宮平滑肌。最初主要用于人類哮喘和動(dòng)物肺部疾病，又稱氨哮素、雙氯醇胺，還具有抗炎和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性作用以及誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用[3]。因偶然發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)蛋白同化作用，且比合成代謝類固醇藥物有更高的選擇性，可減少脂肪的形成，提高瘦肉和脂肪的比率，而在畜禽生產(chǎn)中曾被用作“營(yíng)養(yǎng)再分配劑”及“促生長(zhǎng)劑”，克倫特羅也是至今最有效和應(yīng)用最廣的“再分配劑”。

表1 5種常見“瘦肉精”的基本信息

1.2 萊克多巴胺

萊克多巴胺(RAC，商品名培林)也屬常見的“瘦肉精”。1999年底，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)其作為豬飼料添加劑。它毒性低、代謝快、較少蓄積，更安全高效。如今，美洲和亞洲的20多個(gè)國(guó)家允許其使用，但規(guī)定豬肉上市前，殘余量須低于50 ppb(相當(dāng)于每kg豬肉中含50μg)，以免造成中毒。還有國(guó)家或機(jī)構(gòu)允許其使用，但殘余量允許范圍更低。

聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA)及其它國(guó)家根據(jù)自己國(guó)民飲食的習(xí)慣等制定了自己牛肉和豬肉的最高殘留允許量(Maximum Residue Limits, MRL)標(biāo)準(zhǔn)(見表2)。

表2 萊克多巴胺在各國(guó)的最大殘留容許量標(biāo)準(zhǔn) 單位：μg/kg

1.3 檢測(cè)方法

生物樣品中β-興奮劑殘留量的檢測(cè)具有重要意義，不僅可以用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究，還可以為飼養(yǎng)業(yè)及體育運(yùn)動(dòng)中濫用β-興奮劑提供證據(jù)。但因其在生物樣品中的含量很低，檢測(cè)限要達(dá)到ng/mL的水平，這對(duì)樣品的前處理提出了很高的要求，檢測(cè)也具有一定的難度。

目前已經(jīng)開發(fā)了一些方法用于分析“瘦肉精”，主要是氣相色譜法(GC)與高效液相色譜(HPLC)法，所用檢測(cè)器主要為質(zhì)譜(MS)檢測(cè)器和紫外(UV)檢測(cè)器，少量為薄層色譜法(TLC)[4]和免疫分析(IA)法[5]。分析涉及的生物樣品有血、尿、肝臟及毛發(fā)等[6]。

標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法方面，國(guó)標(biāo)及歐盟檢測(cè)多為質(zhì)譜法。我國(guó)衛(wèi)生部和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)制訂了多種β-興奮劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，如動(dòng)物性食品樣品中的克倫特羅采用GC-MS定量分析，檢測(cè)限為0.5 μg/kg[7]；飼料中的沙丁胺醇、萊克多巴胺等多種β-興奮劑采用LC-MS進(jìn)行定量分析，其檢測(cè)限均為10 μg/kg。我國(guó)現(xiàn)行部分相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中瘦肉精的檢測(cè)方法見表3。

表3 我國(guó)現(xiàn)行部分標(biāo)準(zhǔn)中β-興奮劑的檢測(cè)方法

續(xù)表1

目前市售快速檢測(cè)卡多為定性檢測(cè)?；谀z體金(硒)紙片的“瘦肉精”快速檢測(cè)卡應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的原理，檢測(cè)對(duì)象主要是血液和尿液。該類試劑條、卡檢測(cè)結(jié)果的誤差很大，易使消費(fèi)者產(chǎn)生誤解。

谷峰等[8]對(duì)β-興奮劑的檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，認(rèn)為酶聯(lián)免疫分析法是目前克倫特羅最佳殘留篩選檢測(cè)法，HPLC法、GC-MS和HPLC-MS法是檢測(cè)飼料及動(dòng)物組織中克倫特羅殘留的最終確認(rèn)方法。但是質(zhì)譜法等只在專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行，并且成本高，檢測(cè)過(guò)程長(zhǎng)，不具備向普通市民推廣的基礎(chǔ)。

毛細(xì)管電泳法應(yīng)用于快速分離和測(cè)定“瘦肉精”在文獻(xiàn)中已有報(bào)道。毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis, CE)又稱高效毛細(xì)管電泳分析法(High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是一種功能強(qiáng)大的分離、分析方法，是分離科學(xué)中繼高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)之后的又一重大進(jìn)展，是近幾年來(lái)分析化學(xué)中發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域之一。

毛細(xì)管電泳(CE)極具吸引力，具有諸多優(yōu)點(diǎn)：分離效率高(理論塔板數(shù)已達(dá)106～107/m)；分析時(shí)間短(一般在30min內(nèi)即可完成一次電泳操作)；消耗的溶劑或樣品體積??；重現(xiàn)性較好；成本低；方法開發(fā)比較容易、可以很方便地與質(zhì)譜等多種檢測(cè)手段集成[9-12]，可采用多種模式來(lái)改變選擇性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍；操作簡(jiǎn)便，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；分離在水相介質(zhì)中進(jìn)行，沒(méi)有或很少產(chǎn)生有機(jī)廢液，污染少，還可提供正交的，互補(bǔ)的分析。分析目標(biāo)涵蓋無(wú)機(jī)離子、有機(jī)分子、對(duì)映體、生物大分子、細(xì)胞等，在分析化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、環(huán)境化學(xué)和醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[13]。膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜(MECC)是基于膠束增溶和電動(dòng)遷移的新型液體色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑形成膠束，溶質(zhì)分子在膠束相和水相分配存在差異從而可實(shí)現(xiàn)分離，這種模式拓寬了普通毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)的應(yīng)用范圍，改善了電泳分離的選擇性[14]，可用于中性物質(zhì)的分離或者區(qū)分手性化合物。

在檢測(cè)器選擇方面，電化學(xué)檢測(cè)器通常在樣品凈化處理較好時(shí)可以得到較高的靈敏度，但不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差且不能作為梯度洗脫條件下的檢測(cè)器。質(zhì)譜檢測(cè)器尤其是二級(jí)質(zhì)譜則作為特異性檢測(cè)器，二級(jí)質(zhì)譜可以彌補(bǔ)色譜分離的不足，對(duì)樣品處理的要求也大大降低。質(zhì)譜檢測(cè)器靈敏度高，特異性好，但價(jià)格昂貴，儀器不普及[6]。UV檢測(cè)器價(jià)格便宜，最為普及，但其選擇性不佳，在分離效果不好時(shí)易受干擾，且靈敏度不高。二極管陣列檢測(cè)器(Diode array detector，DAD)，利用多元陣列檢測(cè)器進(jìn)行多通道同時(shí)檢測(cè)多波長(zhǎng)，在一定程度上可以彌補(bǔ)紫外固定波長(zhǎng)檢測(cè)器選擇性不好的缺陷，自動(dòng)掃描檢測(cè)器則有更大的優(yōu)越性：它既可提供色譜圖，又可提供光譜圖，能為化合物的鑒定提供定性資料。二極管陣列檢測(cè)器結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，運(yùn)行可靠，性能優(yōu)良，是一類極有發(fā)展前景的分析儀器檢測(cè)器[15]，是具有很高光強(qiáng)度和需要最佳信噪比的應(yīng)用所選擇的檢測(cè)器。

二極管陣列檢測(cè)器在許多方面勝過(guò)其它檢測(cè)器，其主要特點(diǎn)有[15]：(1)掃描速度快，同時(shí)將機(jī)械驅(qū)動(dòng)部分減少到最小限；(2)能采用比較光譜法確定峰純度；(3)可鑒定色譜峰；(4)可繪制三維色譜圖；(5)可提高選擇性；(6)適用于微柱分析。二極管陣列檢測(cè)器能高靈敏度地在極短時(shí)間內(nèi)對(duì)全波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，使波長(zhǎng)測(cè)量更準(zhǔn)確、可靠，得到的三維圖譜是傳統(tǒng)機(jī)械式波長(zhǎng)掃描裝置無(wú)法做到的。目前，二極管陣列檢測(cè)器已成為分析化學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、在線過(guò)程控制及工業(yè)在線檢測(cè)等光譜測(cè)量?jī)x器重點(diǎn)選擇的關(guān)鍵部件之一。

不同化合物光譜特征各不相同，如果色譜峰是由均勻的同一種物質(zhì)產(chǎn)生，那么在色譜峰流出的各時(shí)間點(diǎn)，不同波長(zhǎng)的比值為定值。圖1顯示同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)波長(zhǎng)(信號(hào)A和信號(hào)B)的色譜圖，Ratio A：B是兩個(gè)波長(zhǎng)(A/B)的比值圖。純物質(zhì)的色譜圖比值恒定，顯示為一條直線，不純的比值圖是有明顯波動(dòng)[16]。

A：不純物質(zhì)峰B：純物質(zhì)峰

圖1 鑒定峰純度的方法原理圖

段建平等[17]利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳-紫外檢測(cè)方法可同時(shí)測(cè)定飼料中西馬特羅、鹽酸克倫特羅與沙丁胺醇。王偉宇等[18]使用小型化的毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)測(cè)定豬尿和豬飼料中的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇，在7 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)3種分析物的分離檢測(cè)。鄭妍鵬等[19]建立了可用于檢測(cè)豬內(nèi)臟中鹽酸克倫特羅含量的毛細(xì)管電泳電導(dǎo)檢測(cè)方法，采用醋酸/醋酸氨緩沖體系為運(yùn)行電泳介質(zhì)，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，鹽酸克倫特羅的線性范圍為1.2～20 μg/mL，檢測(cè)限為0.6 μg/mL。1997年文獻(xiàn)報(bào)道[20]采用毛細(xì)管電泳結(jié)合二極管陣列(DAD)檢測(cè)3種β-興奮劑，但是其實(shí)驗(yàn)方法還有很大改進(jìn)空間，其檢測(cè)結(jié)果與我們的結(jié)果也有明顯差異。

本研究最優(yōu)條件下可以在14 min之內(nèi)對(duì)檢測(cè)的5種“瘦肉精”進(jìn)行分離檢測(cè)。樣品實(shí)際消耗少，將該法應(yīng)用于樣品的測(cè)定，快速、簡(jiǎn)便、可靠。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)Beckman公司)，彈性無(wú)涂層石英毛細(xì)管柱，內(nèi)徑75 μm，長(zhǎng)60.2 cm(有效分離長(zhǎng)度為50 cm，美國(guó)Beckman公司)。純水機(jī)(PURELAB Classic, ELGA Lab Water, UK)，超聲波清洗機(jī)(天津市瑞普電子儀器公司)，pH計(jì)(丹佛儀器(北京)有限公司)，瑞士梅特勒電子天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)，高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)。

沙丁胺醇和克倫特羅購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，萊克多巴胺、特布他林均購(gòu)自德國(guó)(Dr. Ehrensterfer GmbH)，西馬特羅購(gòu)于加拿大(Toronto Research Chemicals Inc.)，各標(biāo)準(zhǔn)品均按說(shuō)明使用。模擬尿樣來(lái)自健康志愿者。

2.2 溶液的配制

制備0.l mol/L硼砂(Na2B4O7)、5 mol/L NaOH、1 mol/L HCl儲(chǔ)備液，取適量?jī)?chǔ)備液，精確調(diào)節(jié)pH值并加入SDS配成所需的運(yùn)行緩沖液。用超純水配制5種β-興奮劑標(biāo)準(zhǔn)品均為1.0 mg/mL濃度的儲(chǔ)備液，低溫避光保存。其它不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液用運(yùn)行緩沖溶液稀釋得到。其它試劑均為分析純。

2.3 樣品的預(yù)處理

采集的尿液應(yīng)保存于4℃～8℃冰箱中，尿液應(yīng)經(jīng)離心處理，取上清液備用。進(jìn)樣前為防止雜質(zhì)過(guò)多，可將樣品稀釋5倍，并以0.45 um聚丙烯濾膜過(guò)濾。

2.4 毛細(xì)管電泳檢測(cè)條件

按要求配制實(shí)驗(yàn)所需各種緩沖溶液，試液與運(yùn)行緩沖液均經(jīng)0.45 μm聚丙烯濾膜過(guò)濾，并經(jīng)10000 r/min高速離心脫氣5 min。每天電泳操作前毛細(xì)管均依次用甲醇-水(60：40)、0.1 mol/L NaOH、超純水及運(yùn)行緩沖液沖洗5 min。每次進(jìn)樣分析開始前, 均依次用0.1 mol/L NaOH，超純水和對(duì)應(yīng)的運(yùn)行緩沖液沖洗5 min。分析過(guò)程中，樣品分析一次用運(yùn)行緩沖液沖洗一次，連續(xù)電泳分離最多3次后及時(shí)更換運(yùn)行緩沖液，盡量保證兩緩沖液瓶中緩沖液組分和高度一致，以保證分析的精度。本實(shí)驗(yàn)采用壓力進(jìn)樣，20psi(Pounds per square inch)×5s，正極進(jìn)樣，負(fù)極柱上以二極管陣列(DAD)檢測(cè)器190～600nm檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)在恒溫(25℃)、恒濕(相對(duì)濕度60%)的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 基本原理

由5種“瘦肉精”化學(xué)結(jié)構(gòu)式可以看出，其都含有苯環(huán)，而苯環(huán)上的共軛雙鍵會(huì)有紫外吸收，故可以采用紫外檢測(cè)器或二極管陣列(DAD)檢測(cè)器檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器在190到600 nm范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描其對(duì)光的吸收。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，各種物質(zhì)在200 nm附近均有較強(qiáng)的吸收，故采用了200 nm下吸收峰面積進(jìn)行定量。

影響毛細(xì)管電泳分析結(jié)果的因素主要包括毛細(xì)管的電滲流、進(jìn)樣和信號(hào)采集、處理等。其中進(jìn)樣方式優(yōu)化、毛細(xì)管預(yù)處理?xiàng)l件的選擇、電極電解作用的影響、溫度控制和后期的信號(hào)處理尤為重要[21]。

圖2為P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀電泳圖界面。

圖 2 P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀電泳圖界面(右上為固定時(shí)間點(diǎn)處不同波長(zhǎng)下的吸收，右下為三維譜圖)

3.2 緩沖液的選擇

緩沖溶液的類型、濃度(離子強(qiáng)度)、pH 是毛細(xì)管電泳分離條件選擇的重要考慮因素，其會(huì)影響到電滲流、分離速度、分離選擇性、分離度。緩沖溶液的選擇一般無(wú)嚴(yán)格規(guī)律可循。但要滿足一些基本條件：有一定的pH調(diào)節(jié)范圍和足夠的緩沖容量；盡可能選擇濃度高而產(chǎn)生電流小的緩沖溶液；緩沖溶液的表觀淌度接近樣品組分的表觀淌度；對(duì)如多元醇、糖等，可選擇有絡(luò)合能力的緩沖溶液，如硼酸鹽緩沖溶液。

電滲是可控制組分的遷移方向和速度，進(jìn)而影響分離效率和重現(xiàn)性，因此電滲的控制是電泳研究的關(guān)鍵。

v=μeoE=(ε0εζ4πη)E

式中，v為遷移率，μeo為電滲流， E 為電場(chǎng)強(qiáng)，ε0為真空介電常數(shù)，ε為緩沖液介電常數(shù) ，ζ為 Zeta 電勢(shì)，η為粘度。

如上公式所示，一般所有能改變?chǔ)?、ε和η的任何直接或間接的因素都可能用來(lái)控制電滲，直接因素如分離電場(chǎng)、粘度、介電常數(shù)和電動(dòng)勢(shì)等；間接因素有：緩沖液的組成和pH、溫度、管壁性質(zhì)、外加電磁場(chǎng)等。其中溫度和緩沖液的組成通過(guò)影響粘度、介電常數(shù)和管壁的ξ等來(lái)影響電滲。外加電磁場(chǎng)則通過(guò)改變管壁表面的電荷數(shù)量及其分布來(lái)改變電滲。

離子強(qiáng)度(濃度)的變化，引起溶液粘度、擴(kuò)散系數(shù)以及Zeta電勢(shì)的變化，從而影響分離效率和分離度。

實(shí)驗(yàn)考察了氨鹽、磷酸鹽和硼酸鹽等堿性體系對(duì)測(cè)定的影響。發(fā)現(xiàn)硼酸鹽體系作緩沖溶液的分離效果最好，峰形和靈敏度較好。這可能是因?yàn)榕鹗侨彪娮釉樱梢耘c化合物中帶孤對(duì)電子的氨配位形成絡(luò)合陰離子，增加樣品溶解度，減少了因吸附造成的拖尾等影響。

3.3 緩沖液pH的影響

考察硼酸鹽(Na2B4O7-NaOH)緩沖溶液的pH值(pH 9.2～11.5，用5 mmol/L NaOH調(diào)節(jié))對(duì)分離檢測(cè)的影響，結(jié)果如下。

運(yùn)行緩沖液的pH值在CE中起著關(guān)鍵的作用，因?yàn)槠鋾?huì)改變?chǔ)?電位(ζ)，電滲流(EOF)以及分析物的總體電荷，并最終影響遷移時(shí)間和被分析物的分離。另外，改變緩沖溶液的pH，可改變某些組分的離子化狀態(tài)，改變其帶電性質(zhì)和數(shù)量，使淌度發(fā)生變化，而分析物離子狀態(tài)比中性狀態(tài)時(shí)在膠束中分配減少，從而影響選擇性。對(duì)于石英毛細(xì)管，在pH<2.5時(shí)，硅羥基基本不解離，電滲接近于零；而pH>10時(shí)，硅羥基解離基本完全，電滲變化很?。辉趐H=4～10之間，硅羥基的解離度隨pH上升而迅速增加，電滲亦迅速增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了pH值的影響，以獲得最佳的條件。

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了運(yùn)行緩沖液為10 mM的硼酸鹽緩沖液(加入10 mM SDS)的pH值范圍從6至11.8對(duì)檢測(cè)的影響。結(jié)果顯示，pH值低于8.0，檢測(cè)不到明顯的峰，pH9.0、10.0、11.0可見標(biāo)準(zhǔn)物檢出，進(jìn)一步細(xì)化對(duì)比pH9.2(此為未加入NaOH時(shí)pH值)、10.0、10.5、11.0、11.5幾個(gè)pH梯度。推測(cè)提高緩沖溶液的pH，使電滲流增加，縮短分析時(shí)間；另外，改變緩沖溶液的pH，可改變某些組分的離子化狀態(tài)，改變其帶電性質(zhì)和數(shù)量，使淌度發(fā)生變化，而分析物離子狀態(tài)比中性狀態(tài)時(shí)在膠束中分配減少，從而影響選擇性。兩種作用綜合的結(jié)果，在所檢測(cè)的堿性范圍內(nèi)隨pH增大，遷移時(shí)間有的延長(zhǎng)有的變化不明顯。

由圖3可見，pH從9.2上升10.0時(shí)，除CIM外的分析物遷移時(shí)間變化顯著，原因可能在于其解離常數(shù)可能均在pH9.2以上，pH大于其解離常數(shù)后，其帶電荷數(shù)量變化明顯。同時(shí)CLB峰面積有明顯上升。pH從10.0上升到11.5時(shí)，各分析物峰面積未見明顯增強(qiáng)，除CLB外其它4種分析物遷移時(shí)間變動(dòng)較小，推測(cè)其解離后取代的酚基去質(zhì)子化帶負(fù)電荷，使各分析物因?yàn)閹度氲侥z束中的作用受抑制，整體電泳速度下降，與因?yàn)殡x子強(qiáng)度變化引起的電滲流增強(qiáng)作用相互抵消。pH10.5時(shí)分離度和峰形、峰高都較好，分離時(shí)間較短，因此，選擇pH為10.5的最適pH值，分析物能較好地分離。

整體上CLB遷移時(shí)間受pH影響比其它分析物更明顯。

圖3 不同pH緩沖液電泳譜圖的比較

3.4 緩沖液濃度的影響

考察硼酸鹽(Na2B4O7-NaOH)緩沖溶液濃度(5～30 mmol/L)對(duì)分離檢測(cè)的影響，結(jié)果見圖4。

圖 4 不同緩沖溶液的濃度下電泳譜圖比較

緩沖液中的離子主要起導(dǎo)電作用并影響分離效率，是電泳條件選擇的關(guān)鍵因素之一。離子一般通過(guò)影響雙電層的厚度來(lái)影響電滲，離子濃度上升，雙電層厚度減小，電滲下降。離子還可通過(guò)與管壁作用以及影響溶液的粘度、介電常數(shù)、離子活度等來(lái)影響電滲。離子強(qiáng)度(濃度)的變化，引起溶液粘度、擴(kuò)散系數(shù)以及ζ電勢(shì)的變化，而且還會(huì)影響膠束的聚集數(shù)，從而影響分離效率和分離度。

實(shí)驗(yàn)考察硼酸鹽(Na2B4O7-NaOH)緩沖溶液5種濃度(5、10、15、20、25mM)(pH 10.5，加入10mM SDS)對(duì)檢測(cè)的影響。

緩沖液的濃度低于10mM時(shí)CLB等分析物峰面積較小，且與RAC相距過(guò)近，不能得到很好的分離。當(dāng)緩沖液的濃度升高時(shí)，峰面積無(wú)明顯變化，而遷移時(shí)間整體延長(zhǎng)，較高的緩沖液的濃度也可能會(huì)引起的焦耳熱的增加，造成基線不穩(wěn)。因此，該體系中選擇了10 mM的硼酸鹽緩沖液(pH10.5)作為最佳的運(yùn)行緩沖液。

3.5 表面活性劑(SDS)濃度的影響

緩沖溶液添加劑可用于改善分離效率和分離選擇性，緩沖溶液添加劑包括：表面活性劑、有機(jī)溶劑、中性鹽類、手性選擇劑。其中表面活性劑通過(guò)親水端或疏水端與樣品組分作用，影響組分的電泳性質(zhì)，從而改變體系的分離選擇性，與毛細(xì)管內(nèi)壁作用，減小內(nèi)壁的吸附作用，或改變電滲流的大小和方向。十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種陰離子表面活性劑，在實(shí)驗(yàn)中可具有如下作用：增大溶解度，形成膠束，可以使壁表面負(fù)電荷增加，Zeta電勢(shì)增大，電滲流增大。

由于這5種β-興奮劑在側(cè)鏈上都具有一個(gè)共同的β-羥胺基團(tuán)，但芳基部分上的取代基彼此各不相同，如CLB和CIM苯胺取代基團(tuán)，SAL，TER和RAC苯酚取代基團(tuán)。5種β-興奮劑在膠束相和水相之間分配可能存在差異，故考慮采用MECC法分離，通過(guò)在緩沖介質(zhì)中加入SDS增大容量因子，并形成膠束，實(shí)現(xiàn)分離。

SDS在樣品的分離中起決定性作用，加入的濃度必須高過(guò)其臨界膠束濃度(在23℃～28℃時(shí)。SDS的臨界膠束濃度為7～10 mM)。實(shí)驗(yàn)考察了10 mM的硼酸鹽緩沖液(pH10.5)分別加入0、5、10、15、20、25、30mM SDS對(duì)檢測(cè)的影響，結(jié)果顯示，在無(wú)SDS或SDS的濃度<5 mM的介質(zhì)中，樣品無(wú)法分離檢出；SDS的濃度在5 mM時(shí)，SAL和TER樣品峰相互重疊或相距過(guò)近；當(dāng)SDS的濃度增大到10 mM時(shí)，5種樣品可以實(shí)現(xiàn)完全分離；繼續(xù)增大SDS的濃度，樣品的分離度增大，但遷移時(shí)間、背景噪音和焦耳熱也增加，峰會(huì)展寬，因此選擇在緩沖液中加入10 mM的SDS。圖5為不同SDS的濃度下電泳譜圖比較。

圖 5 不同SDS的濃度下電泳譜圖比較

3.6 分離電壓的影響

對(duì)分離電壓對(duì)分析物遷移時(shí)間的影響也進(jìn)行了研究。對(duì)于一個(gè)給定的分離長(zhǎng)度，分離電壓決定電場(chǎng)強(qiáng)度，從而會(huì)影響帶電分析物的遷移速度和電滲流的速度，這反過(guò)來(lái)又決定分析物的遷移時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)中，考察了16、20、24、28 kV(間隔4 kV)分離電壓的區(qū)別。高分離電壓下所有分析物的遷移時(shí)間縮短，同時(shí)，出現(xiàn)雜峰或分離不明顯，也加大了基線噪音并導(dǎo)致分離效率下降。分離電壓太低，峰信號(hào)也較低，且出峰時(shí)間較長(zhǎng)，造成了較差的分辨率和更長(zhǎng)的分析時(shí)間。

在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇20 kV電壓，出峰較快，且峰形較好。

3.7 毛細(xì)管柱溫度的影響

毛細(xì)管柱溫度是毛細(xì)管電泳中對(duì)分離有重要影響的參數(shù)。對(duì)于一個(gè)給定的分離長(zhǎng)度、分離電壓，溫度主要影響溶液的粘度，從而影響電滲流的速度，進(jìn)而影響分析物的遷移時(shí)間、分離度和分辨率。

實(shí)驗(yàn)中，考察了10 mM的硼砂緩沖液(pH10.5加入10 mM SDS)15℃、20℃、25℃、30℃、35℃溫度條件對(duì)檢測(cè)的影響。如圖6所示，溫度對(duì)遷移時(shí)間有著非常顯著的影響，隨著溫度的升高，溶液粘度下降，電泳和電滲速度都增加，遷移時(shí)間明顯降低；但是溫度過(guò)高時(shí)，則更容易產(chǎn)生氣泡，樣品擴(kuò)散加強(qiáng)也導(dǎo)致樣品峰信號(hào)減弱。另外，遷移時(shí)間過(guò)短易導(dǎo)致分辨率下降，為了保證實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性和可對(duì)比性，應(yīng)該嚴(yán)格保證實(shí)驗(yàn)條件下的毛細(xì)管柱溫度。從分辨率優(yōu)先于分離時(shí)間的角度考慮，控制毛細(xì)管柱溫為25℃。

圖 6 不同毛細(xì)管柱溫度下電泳譜圖比較

3.8 有機(jī)溶劑對(duì)檢測(cè)的影響

甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等水溶性有機(jī)溶劑由于能影響和調(diào)節(jié)溶質(zhì)分子在膠束內(nèi)外兩相的分配而常被用作膠束毛細(xì)管電泳緩沖溶液添加劑。另外，由于樣品具有疏水基團(tuán)，加入有機(jī)溶劑還可以增大樣品在緩沖溶液中的溶解度。實(shí)驗(yàn)考察了4種溶劑(10%和20%兩個(gè)濃度下)對(duì)樣品溶液的影響，結(jié)果表明：甲醇、乙醇加入易使某些峰信號(hào)降低或者基線不穩(wěn)，乙腈和丙酮均可明顯改善峰形，20%濃度下還可以明顯縮短遷移時(shí)間。推測(cè)其原因是有機(jī)溶劑改善SDS對(duì)各樣品組分的包合作用。增強(qiáng)相對(duì)電遷移速率的同時(shí)，減少所檢測(cè)的藥物分子的負(fù)電荷密度，進(jìn)而降低了本身反方向的電泳速度。

乙腈的加入可以增強(qiáng)電滲流。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證乙腈對(duì)檢測(cè)的影響發(fā)現(xiàn)：隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加，樣品的遷移時(shí)間先增加(0～15%)，后降低(15%～20%),樣品的峰高在乙腈體積分?jǐn)?shù)為15%后降低。這可能是因?yàn)殡S著有機(jī)溶劑的增加，樣品的分配系數(shù)和體系的粘度降低，同時(shí)導(dǎo)致溶液的介電常數(shù)增加。這兩種相反的趨勢(shì)，使樣品的遷移時(shí)間出現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象。樣品的峰高降低可能是因?yàn)橐译娓淖兞薙DS的臨界膠束濃度，當(dāng)乙腈的體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，增強(qiáng)了膠束形成。當(dāng)乙腈的體積分?jǐn)?shù)增大到一定程度時(shí)，阻礙了膠束形成，使樣品的峰面積降低。但是添加有機(jī)溶劑也會(huì)使得遷移時(shí)間縮短后某些物質(zhì)峰相距過(guò)近，使直接稀釋樣品的藥物峰難于分辨，而對(duì)于有機(jī)溶劑萃取的樣品則不會(huì)存在這樣的問(wèn)題，故可以視情況考慮有機(jī)溶劑的添加與否。圖7為添加兩種濃度的乙腈后電泳譜圖比較。圖8為添加兩種濃度的丙酮后電泳譜圖比較。

圖 7 添加兩種濃度的乙腈后電泳譜圖比較

圖 8 添加兩種濃度的丙酮后電泳譜圖比較

3.9 線性范圍、檢出限和精密度

配制了一系列不同濃度的沙丁胺醇、特布他林、萊克多巴胺和西馬特羅對(duì)照品溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下考察其線性范圍及檢出限，結(jié)果見表4。10 mg/L 的沙丁胺醇、特布他林、萊克多巴胺和西馬特羅重復(fù)20次進(jìn)樣，峰面積和遷移時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別低于9.3% 和8.1%。

3.10 樣品測(cè)定與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下按照外標(biāo)法進(jìn)行定量，將尿液樣品稀釋5倍并在其中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表5。

表4 線性范圍、回歸方程和檢出限

表5 樣品測(cè)定與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

注：回收測(cè)得含量為3次測(cè)量結(jié)果的平均值。

由圖9可見，一次進(jìn)樣，在分離體系中同時(shí)得到5種樣品的檢測(cè)峰。加標(biāo)樣品同標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)峰的遷移時(shí)間基本相同。因此對(duì)于上述化合物，采用膠束毛細(xì)管電泳檢測(cè)系統(tǒng)，在分離譜圖上通過(guò)遷移時(shí)間的比較可以進(jìn)行樣品峰的確證。若不一致，則為雜質(zhì)峰。

圖 9 標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)際樣品的膠束毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)結(jié)果圖

4 結(jié)論

采用基于膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)和二極管陣列(DAD)檢測(cè)5種β-興奮劑，該方法簡(jiǎn)單而可靠。在最佳條件下，5種β-興奮劑的檢測(cè)限為0.1～0.2 μg/ mL的(S/N>3)，14 min之內(nèi)可實(shí)現(xiàn)基線分離。通過(guò)分析尿樣加標(biāo)樣品驗(yàn)證了其適用性。

有文獻(xiàn)報(bào)道使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)β-興奮劑，可以達(dá)到μg/L數(shù)量級(jí)以下，與之相比毛細(xì)管電泳方法作為一種藥物殘留檢測(cè)方法雖具有自己的優(yōu)點(diǎn)，但使用二極管陣列(DAD)檢測(cè)器，檢測(cè)限還有待提高。本實(shí)驗(yàn)中DAD譜圖比較判斷5種藥物峰均為純物質(zhì)峰，故未在結(jié)果中詳細(xì)論述。使用激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測(cè)器還可提高儀器靈敏度[22]，檢測(cè)限可達(dá)ng/mL，但是需要衍生化處理。另外，有機(jī)溶劑對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響非常明顯，無(wú)論峰形和峰面積都可能隨著有機(jī)溶劑的加入而顯著變化，對(duì)于實(shí)際中各種形式的具體樣品，值得再深入、細(xì)致地研究。

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