HPLC波長切換法同時測定桂枝茯苓丸中4種成分

于 艷，張立德，田 原，韓 毅，樊 暉，孫科峰*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽 110032;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽 110032)

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁5味中藥按等劑量組成［1］，源于漢代名醫(yī)張仲景的《金匱要略》，具有活血，化瘀，消癥之功［2］。現(xiàn)代藥理研究其具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用，能抑制膀胱癌細(xì)胞增殖［3］，可治療宮頸癌［4］，子宮肌瘤［5-6］，子宮內(nèi)膜異位癥［7］，男性精索靜脈曲張引起的不育［8］，保護腦缺血再灌注損傷［9］等。對本方中活性成分的定量測定，文獻報道多為其中的1種或2種成分的測定［10-12］，本實驗采用反相高效液相色譜波長轉(zhuǎn)換法，同時對桂枝茯苓丸中的4種成分即芍藥苷、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚進行測定，為該制劑的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Agilent1100高效液相色譜儀，G1379A真空脫氣機，G1311A四元梯度泵，G1313A自動進樣器，G1315柱恒溫箱，G1315B二極管陣列檢測器;Agilent B 0403色譜工作站;AE-240電子分析天平;KH-400DB型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 試藥 芍藥苷、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110736-201136、 111595-200604、 110710-200212、110708-200505，純度均為98%以上。桂枝茯苓丸為市售大蜜丸(山西萬輝制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z14020065，規(guī)格:6 g/丸)。乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)。流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～10 min(12% ～15%A)，10～15 min(15% ～30%A)。檢測波長為230 nm(0～10 min)，290 nm(10～30 min)。體積流量1.0 mL/min。柱溫30℃。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚對照品適量，置同一量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含芍藥苷 143.25μg、肉桂酸 9.03μg、桂皮醛 7.73μg、丹皮酚25.70μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品剪碎，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(功率400 W，頻率40 kHz)處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照液的制備 按處方及工藝制備不含桂枝的樣品，再按“供試品溶液的制備”項下制備成桂枝陰性對照液。另按處方及工藝制備同時不含赤芍和牡丹皮的樣品，再按“供試品溶液的制備”項下制備成赤芍和牡丹皮陰性對照液。

2.5 測定法 分別精密吸取對照品溶液5μL、供試品溶液及陰性對照液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄液相色譜圖。由色譜圖可知，在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上供試品具有相同保留時間的色譜峰，陰性對照液在此峰位無吸收，對本品各成分的測定無干擾，見圖1。

圖1 桂枝茯苓丸HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of Guizhi Fuling Pills

2.6 線性范圍考察 分別精密吸取混合對照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μL，注入色譜儀，記錄色譜峰面積，進樣量X(μg)與峰面積Y經(jīng)線性回歸，得回歸方程為:芍藥苷Y=1306.1 X+0.7732，r=0.9998;肉桂酸 Y=6394.5 X－3.7989，r=0.9999;桂皮醛 Y=10985.0X－5.7339，r=0.9999;丹皮酚 Y=3029.9 X－10.0610，r=0.9999。芍藥苷在0.1433～3.5813μg，肉桂酸在0.0090 ～0.2258μg，桂皮醛在0.0077 ～ 0.1933μg，丹皮酚在0.0257～0.6425μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液5μL，連續(xù)進樣6次，結(jié)果峰面積值的RSD分別為芍藥苷0.29%、肉桂酸0.21%、桂皮醛0.44%、丹皮酚0.34%，表明本儀器精密度較好。

2.8 重復(fù)性試驗 取本品(批號120110)6份，研細(xì)，分別制備成供試品溶液，按測定方法測定，結(jié)果平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為芍藥苷2.1941 mg/g、肉桂酸0.0271 mg/g、桂皮醛0.4821 mg/g、丹皮酚0.7654 mg/g，RSD分別為芍藥苷1.31%、肉桂酸1.98%、桂皮醛0.97%、丹皮酚1.01%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號120110)，分別在0、2、4、6、8、10 h測定峰面積，結(jié)果峰面積RSD分別為芍藥苷0.18%、肉桂酸0.98%、桂皮醛1.24%、丹皮酚2.01%，表明本品溶液10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的供試品(批號120110)0.25 g，共計6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對照品溶液(含芍藥苷0.5450 mg/mL，肉桂酸7.5000μg/mL，桂皮醛0.1180 mg/mL，丹皮酚0.2005 mg/mL)1.0 mL，蒸干溶劑，按“供試品溶液制備”項下制備，進行測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率實驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.11 樣品測定 取本品，按上述方法制備成供試品溶液，精密吸取對照品溶液5μL和供試品溶液20μL，再按本實驗選定的色譜條件測定峰面積，用外標(biāo)一點法計算樣品中4種成分的量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 在供試品溶液的制備過程中，本實驗對提取方法、提取溶劑和提取時間進行了考察，分別選用50%甲醇、甲醇和乙醇為提取溶劑，考察了超聲提取、加熱回流提取及索氏提取3種方法，并對超聲提取時間進行了考察，結(jié)果以本實驗所述方法為最佳供試品制備方法。

表2 樣品測定結(jié)果(，n=5，mg/丸)Tab.2 Determination results of four constituents(，n=5，mg/pill)

表2 樣品測定結(jié)果(，n=5，mg/丸)Tab.2 Determination results of four constituents(，n=5，mg/pill)

樣品批號 芍藥苷 肉桂酸 桂皮醛 丹皮酚120110 13.6458±0.3738 0.1662±0.0036 2.8974±0.0336 4.6824±0.0936120112 13.0416±0.3258 0.1776±0.0036 3.1866±0.0576 4.8966±0.1134120511 13.5372±0.3300 0.1482±0.0030 2.8284±0.0312 4.5024±0.0816120601 13.5714±0.2928 0.1542±0.0042 2.9592±0.0600 5.2260±0.1248120602 13.2348±0.3366 0.1692±0.0030 3.3084±0.0762 5.0274±0.1026

3.2 本方所含赤芍及牡丹皮兩味藥中均含有芍藥苷和丹皮酚［13-15］，在實驗過程中也曾分別制備赤芍陰性液和牡丹皮陰性液，結(jié)果兩藥互相干擾，與文獻報道一致，因此在考察本制劑的質(zhì)量時以兩藥中的總芍藥苷和丹皮酚為考察指標(biāo)。

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