華淺近， 祖茂衡， 滕 飛， 王 磊， 胡 琳

我國布加-綜合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）以下腔靜脈和（或）肝靜脈開口處隔膜阻塞型為主，其特征是下腔靜脈和（或）肝靜脈開口處隔膜形成，而隔膜的形成機(jī)制至今尚未明確［1］。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞為該隔膜主要構(gòu)成成分之一，隔膜組織中成纖維細(xì)胞生長因子受體 （fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）的表達(dá)明顯高于正常血管壁組織［2］。此外，國內(nèi)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)BCS的發(fā)病率與飲用水中碘含量呈正相關(guān)［3］，同時一定濃度的高碘培養(yǎng)環(huán)境能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［4-5］。

本研究以CCK-8檢測法［6］檢測FGFR抑制劑SU5402與適宜濃度碘離子共同作用下成纖維細(xì)胞的增殖情況，應(yīng)用免疫印跡法檢測不同濃度碘離子培養(yǎng)環(huán)境中成纖維細(xì)胞的堿性成纖維細(xì)胞生長因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF）、FGFR2 蛋白表達(dá)的情況，探討高碘促成纖維細(xì)胞增殖作用與bFGF、FGFR2的關(guān)系及與下腔靜脈隔膜形成的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株培養(yǎng)

HFL1人肺成纖維細(xì)胞（目錄號GNHu28）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞培養(yǎng)于Corning培養(yǎng)皿中，采用F12K培養(yǎng)基（Sigma公司），加10%胎牛血清 （Gibco公司）。于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁生長匯合即可傳代，每周傳代2次，選取第5～6代細(xì)胞用于實驗。

1.2 細(xì)胞增殖檢測

取對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計數(shù)板作細(xì)胞計數(shù)，測定細(xì)胞密度，再用培養(yǎng)基稀釋至5×104個/ml。將細(xì)胞懸液接種至96孔板中，每孔約5 000個細(xì)胞，分為5組：①空白對照組 （每孔100 μl細(xì)胞懸液，20 μl F12K培養(yǎng)基）； ② 溶媒組 （每孔 100 μl細(xì)胞懸液，19 μl F12K 培養(yǎng)基，1 μl DMSO）； ③ KI組 （每孔 100 μl細(xì)胞懸液，15 μl F12K 培養(yǎng)基，5 μl KI）；④ SU5402組（每孔 100 μl細(xì)胞懸液，15 μl F12K 培養(yǎng)基，5 μl SU5402）；⑤ SU5402 和 KI共同作用組（每孔 100 μl細(xì)胞懸液，10 μl F12K 培養(yǎng)基，5 μl SU5402，5 μl KI）。以上各組均設(shè)6個復(fù)孔，其中③、⑤組的碘終濃度為1 000 μg/L，④、⑤組的SU5402終濃度為100 μmol/L。 隨后于 37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，更換新的F12K培養(yǎng)基，每孔再加入CCK-8 工作液（日本同仁）10 μl，孵育 40 min。 以F12K培養(yǎng)基加CCK-8工作液孔作為本底調(diào)零，于450 nmol/L波長處測定各孔吸光度（A）值，間接反映細(xì)胞數(shù)量，各組A值去除1個最高值和1個最低值。以上實驗重復(fù)3次。

1.3 bFGF、FGFR2蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期成纖維細(xì)胞1∶6傳代，培養(yǎng)48 h后換液，設(shè)空白對照組和碘離子組?？瞻讓φ战M直接用F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)。碘離子組：在F12K培養(yǎng)基中分別加入碘化鉀，使碘離子終濃度分別為 250、500、1 000、2 000 和 3 000 μg/L，再將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育12 h。采用Western印跡法檢測bFGF、FGFR2蛋白表達(dá)。用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測蛋白濃度、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和免疫反應(yīng)。bFGF、FGFR2一抗（Abcam公司）均以1∶500稀釋，二抗稀釋比均為1∶1 000。顯色方法為5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/氯化硝基四氮唑藍(lán)（BCIP/NBT）發(fā)色顯色法。以上條帶均以β-actin作為內(nèi)參照。掃描后采用IPP6.0圖像分析軟件對特異性條帶進(jìn)行半定量分析，以 bFGF/β-acting，F(xiàn)GFR2/βacting的灰度值比值評定bFGF及FGFR2的蛋白表達(dá)水平。以上實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多個實驗組與1個對照組比較采用最小顯著差法（LSD），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGFR抑制劑對成纖維細(xì)胞增殖的影響

空白對照組 （1.06±0.13） 與溶媒組 （1.02±0.11）間細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。KI組 （1.73±0.09）細(xì)胞增殖率明顯高于對照組，SU5402組（0.40±0.12）細(xì)胞增殖率明顯低于對照組，SU5402和KI共同作用組（1.18±0.10）細(xì)胞增殖率高于對照組，但低于KI組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

2.2 不同碘濃度對bFGF、FGFR2蛋白表達(dá)的影響

各碘濃度組與空白對照組比較，bFGF蛋白相對表達(dá)量差無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。500和1 000 μg/L碘濃度組FGFR2蛋白相對表達(dá)量較空白對照組明顯提高，且1 000 μg/L組明顯高于500 μg/L組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1～3。

表1 不同濃度碘環(huán)境中bFGF、FGFR2蛋白相對表達(dá)量

圖1 bFGF、FGFR2蛋白在各組中的表達(dá)

圖2 不同碘濃度對bFGF蛋白相對表達(dá)量的影響

圖3 不同碘濃度對FGFR蛋白相對表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 高碘促成纖維細(xì)胞增殖的作用途徑

國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示，隔膜型BCS患者分布地區(qū)的飲用水中碘含量超過正常標(biāo)準(zhǔn)，并且BCS患者尿碘高于正常人，同時一定濃度的碘能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖［5］。bFGF是FGF家族中最具代表性的成員，它作為重要的促有絲分裂原對成纖維細(xì)胞有明顯的促增殖作用，能趨化血管內(nèi)膜的各類細(xì)胞并促進(jìn)其增殖和遷移，在損傷修復(fù)過程促進(jìn)細(xì)胞膠原酶的產(chǎn)生從而加速膠原分解，并通過促進(jìn)基底膜纖維的重新排布使基質(zhì)層纖維有序排布，達(dá)到減少瘢痕形成的作用［7］。FGFR是一類穿膜的酪氨酸激酶受體，介導(dǎo)FGF信號傳遞入細(xì)胞，分1～6個亞型，其中FGFR1、2為bFGF高親和力受體。FGF/FGFR途徑在細(xì)胞增殖和分化、創(chuàng)傷愈合和腫瘤細(xì)胞的分裂增殖中起重要作用［8］。

本研究用的 SU5402是 2-［（1-2-二氫-2-氧代-3H-吲哚-3-亞基）甲基］-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸，能靶向作用于FGFRl激酶結(jié)構(gòu)域鉸鏈區(qū)的ATP結(jié)合位點，由于FGFR之間的結(jié)構(gòu)和序列相似，可通過與ATP結(jié)合而抑制FGFR2的磷酸化，從而也抑制FGFR2的活性［9-10］。本文結(jié)果顯示，KI組細(xì)胞增殖率明顯高于對照組，與劉小琴等［5］發(fā)現(xiàn)的碘離子濃度 ≤3 000 μg/L具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡作用的結(jié)果相符。而對于高碘促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制少見報道。騰飛等［11］在體外以高碘環(huán)境培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)碘離子促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并非通過提高血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體（VEGFR）的蛋白表達(dá)量實現(xiàn)，同時發(fā)現(xiàn)高碘能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受體VEGFR-2（Tyr1214）磷酸化水平上調(diào)而介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均為BCS隔膜的主要成分，高碘培養(yǎng)環(huán)境能引起兩者的增殖，本研究以高碘對BCS隔膜另一主要成分的成纖維細(xì)胞增殖機(jī)制為切入點進(jìn)行研究，結(jié)果顯示SU5402組細(xì)胞增殖率明顯低于對照組，表明成纖維細(xì)胞增殖依賴于FGFR1和（或）FGFR2作用。SU5402聯(lián)合KI共同作用組細(xì)胞增殖率低于KI組，但仍高于對照組，表明高碘對成纖維細(xì)胞的促增殖作用不僅通過對FGF/FGFR途徑刺激實現(xiàn)，還通過其他途徑實現(xiàn)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 高碘與bFGF、FGFR2蛋白表達(dá)的關(guān)系及意義

FGFR2是bFGF的高親和力受體，在bFGF促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移過程中起至關(guān)重要的作用［7］。FGFR2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而被認(rèn)為是腫瘤治療的重要靶點，但其在血管內(nèi)隔膜形成過程中的作用尚少見報道。

本研究的Western印跡結(jié)果顯示，碘濃度500和1 000 μg/L組的FGFR2蛋白表達(dá)明顯提高，且1 000 μg/L組明顯高于 500 μg/L組，提示高碘離子能促進(jìn)成纖維細(xì)胞FGFR2蛋白表達(dá)且呈濃度相關(guān)性。碘離子對成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡具有雙向效應(yīng)，較低濃度的碘離子對成纖維細(xì)胞增殖起明顯的促進(jìn)作用，隨著碘離子濃度的升高促進(jìn)作用逐漸消失，碘離子濃度較高時成纖維細(xì)胞增殖活性受到抑制，高碘對成纖維細(xì)胞的作用呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系［5］，本研究發(fā)現(xiàn)碘濃度 2 000 和 3 000 μg/L 組的FGFR2蛋白表達(dá)低于500和1 000 μg/L組，與空白對照組無明顯差異，說明高碘對成纖維細(xì)胞FGFR2蛋白表達(dá)的影響也存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。bFGF通過與其低親和力受體硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）結(jié)合，再通過HSPG結(jié)合到FGFR上。研究表明，2個FGFR2蛋白分子與1個HSPG分子結(jié)合，F(xiàn)GFR2的Y657位點發(fā)生二聚化，并發(fā)生自磷酸化而活化形成穩(wěn)定的二聚體［12］。FGFR2活化后可磷酸化成纖維細(xì)胞生長因子受體底物 2（FRS2）［13］，募集生長因子受體結(jié)合蛋白2（GRB2），而后激活蛋白激酶C（protein kirmse C，PKC）、Ras/Raf/MEK/ERK 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)功能。FGFR2蛋白表達(dá)量的提高將強(qiáng)化上述作用過程，導(dǎo)致包括成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞增殖條件發(fā)生紊亂，刺激細(xì)胞內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［14］。因此，高碘可能通過上調(diào)FGFR2蛋白表達(dá)量對成纖維細(xì)胞產(chǎn)生促增殖作用，而具體作用機(jī)制和激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還需深入研究。各碘濃度組成纖維細(xì)胞bFGF蛋白表達(dá)量無明顯差異，提示高碘促成纖維細(xì)胞增殖作用并非通過提高bFGF蛋白表達(dá)量實現(xiàn)，高碘對HSPG、FRS2、GRB2蛋白表達(dá)及對bFGF降解膠原作用是否有影響還需進(jìn)一步證實。

3.3 高碘與BCS隔膜組織形成的相關(guān)性

目前研究發(fā)現(xiàn)，我國隔膜型BCS病例的地理分布和水源性高碘地區(qū)分布基本相符，并且患者尿碘水平明顯高于正常人［3］，這些研究均證實了BCS患者體內(nèi)外的高碘環(huán)境。近年發(fā)現(xiàn)高碘能刺激BCS隔膜主要成分之一的內(nèi)皮細(xì)胞膜受體VEGFR-2（Tyr1214）磷酸化水平上調(diào)而介導(dǎo)肌動蛋白重塑、張力纖維形成及VEC遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，高碘因素可提高FGFR2蛋白表達(dá)量并促進(jìn)其增殖，這與BCS隔膜組織檢測到增殖的成纖維細(xì)胞、高表達(dá)的FGFR結(jié)果相一致。我們推測由于肝靜脈開口處的血流切應(yīng)力、膈肌損傷等因素引起了肝靜脈開口處血管壁損傷［15］，暴露出內(nèi)皮下層的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，而患者血液中高碘因素引起損傷處血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞向管腔內(nèi)遷移，促進(jìn)BCS隔膜的形成。

然而，不同類型BCS的發(fā)病機(jī)制不同，本研究主要針對隔膜阻塞型BCS的隔膜形成機(jī)制，而不能解釋以肝靜脈血栓、閉塞、狹窄形成為特點的單純肝靜脈病變型BCS發(fā)病機(jī)制，單純肝靜脈病變型BCS發(fā)病機(jī)制的研究主要針對血栓形成原因，如JAK2-V617F基因突變、凝血因子Ⅴ基因G1691A突變、紅細(xì)胞增多癥等［1］。此外，在體外高碘環(huán)境單一培養(yǎng)成纖維細(xì)胞無法模擬出動態(tài)變化的人體血液內(nèi)環(huán)境及隔膜的多種細(xì)胞及組織成分，本研究發(fā)現(xiàn)了高碘能上調(diào)FGFR2蛋白表達(dá)量，但具體作用機(jī)制和所激活的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還需深入研究。

［1］ Cheng D，Xu H，Lu ZJ，et al.Clinical features and etiology of Budd-Chiari syndrome in Chinese patients：a single-center study［J］.J Gastroenterol Hepatol， 2013， 28： 1061-1067.

［2］ 白衛(wèi)星，李天曉，翟水亭，等.布-加綜合征隔膜組織病理學(xué)與相關(guān)因素研究［J］.介入放射學(xué)雜志，2008，17：463-467.

［3］ 肖培瑞，藺新英，郭成浩，等.布-加綜合征分布與飲用水碘含量關(guān)系研究［J］.環(huán)境與健康雜志， 2010， 27： 618-620.

［4］ 王曉磊，徐麗雅，張海濤，等.不同碘濃度對培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 ［J］.山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，45：310-312.

［5］ 劉小琴，郭成浩，張海濤，等.碘對成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的影響［J］.環(huán)境與健康雜志， 2010， 27： 568-570.

［6］ 王 濤，李冰晴，王津津，等.CCK-8檢測法研究槲皮素對人Tenon囊成纖維細(xì)胞的抑制作用 ［J］.眼科新進(jìn)展，2007，27：576-580.

［7］ Feng DF，Wang CY，Wang H，et al.bFGF-induced human periodontal ligament fibroblasts proliferation through t-type voltage-dependent Calcium channels ［J］.Acta Odontol Scand，2013， 71：9-14.

［8］ 伊海英，孫曉艷，付小兵，等.堿性成纖維細(xì)胞生長因子的研究進(jìn)展［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2008， 33： 776-778.

［9］ Li M，F(xiàn)irth JD，Putnins EE.An in vitro analysis of mechanical wounding-induced ligand-independent KGFR activation ［J］.J Dermatol Sci， 2009， 53： 182-191.

［10］ Yamauchi K， Mizushima S， Tamada A， et al.FGF8 signaling regulates growth of midbrain dopaminergic axons by inducing semaphorin 3 F［J］.J Neurosci， 2009， 29： 4044-4055.

［11］滕 飛，祖茂衡，華淺近，等.血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程中碘離子與血管內(nèi)皮生長因子及其受體的關(guān)系 ［J］.介入放射學(xué)雜志，2013，22：403-408.

［12］計 薇，孫文靖，張慧姝，等.人成纖維細(xì)胞生長因子受體2的研究進(jìn)展［J］.國際遺傳學(xué)雜志， 2011， 34： 186-195.

［13］ Hadari YR， Gotoh N， Kouhara H， et al.Critical role for the docking-protein FRS2 alpha in FGF receptor-mediated signal transduction pathways ［J］.Proc Natl Acad Sci USA， 2001， 98：8578-8583.

［14］ Katoh Y， Katoh M.FGFR2-related pathogenesis and FGFR2-targeted therapeutics （Review）［J］.Int J Mol Med， 2009， 23：307-311.

［15］周恒根，徐 浩，祖茂衡，等.膈肌運動及血流動力學(xué)與下腔靜脈膜性阻塞關(guān)系的研究 ［J］.介入放射學(xué)雜志，2008，17：729-731.