段麗君,李國瑞,童 俊,葉要妹*
(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,湖北 武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,湖北 武漢 430070;3.武漢市林業(yè)果樹科學(xué)研究所,湖北 武漢 430075)
紫薇(Lagerstroemia indica)隸屬于千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬,別名“百日紅”、“癢癢樹”、“滿堂紅”,主要分布在亞洲東部至南部和澳大利亞的北部[1]。作為園林觀賞植物,紫薇有其獨特的觀賞價值,樹姿優(yōu)美,在夏季少花季節(jié)開花,不僅花期長,而且花色豐富,是重要的園林綠化樹種。紫薇傳統(tǒng)繁殖方式主要是播種和扦插,但繁殖速度慢,性狀易變異。利用組織培養(yǎng)的方法培育苗木,具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)高、保持繁殖材料及新植株的優(yōu)良種性,從而提高種苗質(zhì)量,具有重要的意義及應(yīng)用前景[2]。但長期以來,有關(guān)紫薇離體培養(yǎng)研究報道比較少,1984年黃欽才[3]最早報道培養(yǎng)利用紫薇腋芽快速繁殖,楊彥伶[4]、瞿宏杰[2]需經(jīng)過6 ~7 次繼代培養(yǎng),得到每叢20 ~50 個叢生芽,李曉青[6]和曹受金[2]探討紫薇莖段誘導(dǎo)、增殖、生根的培養(yǎng)基配方?,F(xiàn)國內(nèi)已獲得了紫薇腋芽的增生[3,6-8],枝條的快繁[9],葉片的再生[10]和種子無菌苗[5],但多局限于培養(yǎng)基配方的優(yōu)化,沒有建立從外植體消毒到生根煉苗比較系統(tǒng)、穩(wěn)定的再生體系,難以滿足科研、生產(chǎn)的需求?,F(xiàn)以紫薇莖段為材料,旨在通過消毒時間、取材季節(jié)、基本培養(yǎng)基、激素配比等一系列的研究,確定適宜于紫薇莖段植株再生的最佳途徑,建立、完善其離體再生體系,從而滿足紫薇及其相關(guān)樹種的樹木改良研究及其優(yōu)良苗木快速繁殖的需要。
在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地內(nèi)選擇株高2 m左右、生長健壯的2~3年生優(yōu)良紫薇單株。
1.2.1 莖段消毒時間的篩選 5月份,選取紫薇當(dāng)年生的中上部枝條,剪取帶腋芽莖段和頂芽莖段部分,分別用洗衣粉水清洗后流水沖洗30 min以上。然后,在超凈工作臺上,分別用75%的酒精處理30 s,無菌水沖洗2~3次,接著用0.1%的升汞處理,具體是帶腋芽莖段分別處理6,8,10 min,頂芽莖段分別處理4,6,8 min,無菌水沖洗3~5次,最后用無菌濾紙吸干外植體上的水分,分別接種于MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上。然后將其放于培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng),每個處理10個外植體,重復(fù)3次,15 d后統(tǒng)計污染率,萌發(fā)率、褐化率。
污染率:污染的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%;褐化率:褐化的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%;萌發(fā)率:萌發(fā)外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。
1.2.2 取材時間對帶芽莖段萌發(fā)的試驗 分別于春季4月、夏季6月、秋季9月3個不同時間段取材對莖段進(jìn)行試驗,將帶腋芽莖段接種到培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L上。每個處理10個外植體,重復(fù)3次,觀察外植體污染率、腋芽萌發(fā)率及其生長情況。
1.2.3 帶芽莖段的初代培養(yǎng) 試驗采用雙因素完全隨機設(shè)計,6-BA 3個水平為0.5,1.0,2.0 mg/L,NAA 2個水平為0.05,0.1 mg/L,共6個處理組合。消毒后將帶頂芽莖段和帶腋芽莖段分別接種到6個處理組合中,每個處理10個外植體,重復(fù)3次。第15天統(tǒng)計污染率和萌發(fā)率。
1.2.4 帶芽莖段的增殖 第15天將初代培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽和頂芽切取轉(zhuǎn)接到4種增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng):(1)MS+6 - BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L;(2)MS+6 - BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L;(3)MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(4)MS+6 -BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。1 個月后再次繼代與原培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基上,每個處理10個外植體,重復(fù)3次,培養(yǎng)30 d后觀察腋芽和不定芽發(fā)生狀況,統(tǒng)計增殖倍數(shù)。增殖倍數(shù):腋芽增殖的芽總數(shù)/外植體總數(shù)。
1.2.5 壯苗培養(yǎng) 以紫薇增殖苗為外植體進(jìn)行試驗,培養(yǎng)基設(shè)3個處理,(1)MS;(2)MS+GA30.5 mg/L;(3)MS+GA31.0 mg/L,每個處理10個外植體,重復(fù)3次,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計株高及生長情況。
1.2.6 生根培養(yǎng) 在繼代叢生芽中選取生長良好,長度在2 cm以上的嫩枝,切去基部愈傷,將其接入以 1/2MS 為基本培養(yǎng)基,同時分別附加 IBA 0.2,0.5,1.0 mg/L 或 NAA0.2,0.5,1.0 mg/L 3 個濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),每個處理10個外植體,重復(fù)3次,40 d后統(tǒng)計生根率、生根數(shù)、平均根長。
生根數(shù):長度大于0.5 cm的根個數(shù);生根率:生根的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。
1.2.7 數(shù)據(jù)觀測與統(tǒng)計分析 如無特別交代,本實驗中的初代、繼代及分化的基本培養(yǎng)基為MS,瓊脂含量為7.0 g/L,蔗糖濃度為30 g/L;生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為1/2MS,瓊脂為7.0 g/L;培養(yǎng)基pH值:5.8~6.0。滅菌條件:121℃、1.1 kg/cm2滅菌 20 min;培養(yǎng)室條件:溫度為(25±2)℃、光強為1 400 lx、光周期為14 h光/10 h暗的條件。
試驗數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,百分率的數(shù)據(jù)分別先經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換、對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析和多重比較。
表1 不同消毒時間對紫薇外植體消毒的影響Tab.1 Effects of different sterilization treatment on survival of Lagerstroemia indica
外植體的消毒處理對進(jìn)行組織培養(yǎng)研究有著至關(guān)重要的作用,消毒時間恰當(dāng),可以減少外植體的污染和材料的損失。從表1可以得出HgCl2處理時間對紫薇的腋芽莖段污染率和褐化率有顯著影響,對萌發(fā)率有極顯著的影響,進(jìn)一步的多重比較結(jié)果顯示:帶腋芽的莖段用HgCl2溶液消毒6 min萌芽率最高,褐化率最低,污染率也相對較小,效果最佳;帶頂芽的莖段在用HgCl2溶液消毒4 min萌芽率高,污染率和褐化率均較低,效果好。
表2 取材季節(jié)對腋芽萌發(fā)的影響Tab.2 Effects of sampling time on germinating
取材季節(jié)對腋芽莖段的污染率和萌發(fā)率均有極顯著的影響,進(jìn)一步的多重比較結(jié)果顯示,污染率的高低順序是:秋季、夏季、春季,萌發(fā)率的高低順序是:夏季、秋季、春季,且試驗觀察到夏季和秋季萌條的生長勢好于春季萌發(fā)的。綜合污染率、萌發(fā)率及萌條的生長勢,夏季的腋芽莖段培養(yǎng)效果最好。
方差分析結(jié)果表明,6-BA和NAA濃度對紫薇莖段腋芽的萌發(fā)率均達(dá)顯著的影響,6-BA和NAA不同濃度之間的交互作用對紫薇莖段腋芽的萌發(fā)率作用不明顯。從表3可以得出6-BA濃度為1.0 mg/L時萌芽率最高,萌發(fā)率和芽長都顯著好于0.5 mg/L時的,但6-BA濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L兩者萌發(fā)率和芽長沒有顯著性差異;NAA在濃度為0.1 mg/L時的萌芽率要顯著好于0.05 mg/L的。理論上,誘導(dǎo)紫薇莖段萌發(fā)效果比較好的是6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 這兩個組合。
表3 6-BA和NAA對帶腋芽莖段萌發(fā)的影響Tab.3 Effects of 6 -BA and NAA on ratio of shooting
由表4的6-BA和NAA不同濃度組合對腋芽誘導(dǎo)率及芽生長勢的實際效果來看,6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L這兩個組合的萌發(fā)率較高。隨著培養(yǎng)時間的延長,腋芽的生長情況有所不同。在濃度為1.0 mg/L時腋芽生長健壯(圖1-A);濃度為2.0 mg/L時腋芽生長速度快,芽長但節(jié)間較長,苗細(xì)弱。因此,根據(jù)萌發(fā)率、生長勢及增殖倍數(shù)的結(jié)果,帶腋芽莖段的初代培養(yǎng)基選用 MS+6 -BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。
表4 不同組合處理對紫薇帶腋芽莖段誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effects of different treatment on axillary bud induction
切取初代培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽繼代于不同處理的培養(yǎng)基上,開始繼代時,只有腋芽萌發(fā)增殖;經(jīng)過4次繼代后,莖基部出現(xiàn)了大量叢生芽(圖1-B)。4個處理中都有叢生芽發(fā)生,表5方差分析表明,各處理間對平均芽個數(shù)及叢生芽長有顯著性差異,多重比較結(jié)果顯示:處理3誘導(dǎo)叢生芽個數(shù)為61個,顯著高于處理1和處理4,處理2和處理3誘導(dǎo)的芽較處理4的生長健壯。綜合比較平均芽個數(shù)及叢生芽長可知,在處理3的培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L上對莖段腋芽的增殖效果最為理想。
表5 BA、NAA不同濃度組合對莖段腋芽的增殖影響Tab.5 Effects of 6 -BA and NAA on buds multiplication
將紫薇的再生芽在附加了不同濃度GA3的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月后,表6方差分析結(jié)果表明不同處理對試管苗的生長量有極顯著影響。處理1的苗生長量極顯著地高于處理2和處理3。在不添加GA3的MS培養(yǎng)基上苗生長量最高,葉片綠色(圖1-C)。GA3對取自叢生芽的芽苗伸長生長的促進(jìn)作用不明顯,苗甚至不生長,隨著培養(yǎng)時間的延長,葉片發(fā)黃直至脫落(圖1-D)。GA3對紫薇無菌苗的伸長生長沒有促進(jìn)作用,因此,在紫薇叢生苗的繼代培養(yǎng)中可以不添加激素。
表6 GA3對叢生苗生長的影響Tab.6 Effects of GA3on axillary buds growth
表7 生長素對試管苗生根的影響Tab.7 Effects of auxins on rooting of plantlets in vitro
圖1 紫薇帶芽莖段的快繁Fig.1 Rapid propagation of budded stem segmant of Lagerstroemia indica
表7方差分析表明,IBA對紫薇試管苗的生根率有極顯著的影響,NAA對生根率無顯著影響,但添加了生長素的1/2MS培養(yǎng)基的試管苗生根率均極顯著地高于未添加生長素的1/2MS培養(yǎng)基。進(jìn)一步的多重比較結(jié)果表明,處理3的生根率卻極顯著地高于處理5和處理7;同時,結(jié)合生根率、生根數(shù)和平均根長的結(jié)果,試管苗生根應(yīng)在1/2MS培養(yǎng)基上添加濃度為0.5 mg/L的IBA。生根的健壯苗即可煉苗移栽(圖1-E、圖1-F)。
紫薇莖段直接從大田采集,不同季節(jié)生長狀態(tài)不同,取材季節(jié)對芽的萌動有顯著影響。本研究表明,在高溫干燥的夏季截取半木質(zhì)化莖段作組織培養(yǎng),污染率較低,萌芽率高且生長勢健康,效果明顯好于春季和秋季。這與紫薇在夏季生長旺盛、枝條半木質(zhì)化、表面污染物少和植株內(nèi)源激素含量高都有明顯關(guān)聯(lián)。在本實驗中,紫薇春季剛萌發(fā)的莖段幼嫩,容易產(chǎn)生藥害,消毒處理后,極易褐化,腋芽萌芽率低。而在秋季取材的莖段已完全木質(zhì)化,內(nèi)生菌積累較多,污染率高,應(yīng)相應(yīng)延長消毒時間為宜。這在巴戟天[11],柑橘[12],香椿[13]的研究上有類似報道。
培養(yǎng)基中的生長素和細(xì)胞分裂素對紫薇叢生芽誘導(dǎo)、增殖和生根有顯著作用。本研究通過系列激素配比實驗,篩選出紫薇莖段誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基最佳配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,生根最佳配方為1/2MS+IBA0.5 mg/L。研究結(jié)果顯示紫薇莖段在最佳激素配比的培養(yǎng)基上,萌芽率可高達(dá)97.6%,經(jīng)過4次繼代出現(xiàn)了大量叢生芽,平均不定芽苗(長度大于1 cm)達(dá)61個且生長強壯,繼代次數(shù)少,見效快,能夠大量運用于快繁生產(chǎn)。紫薇莖段快繁體系的建立,為紫薇的繁殖添加了新途徑,對保存紫薇優(yōu)良性狀,加快紫薇工廠化生產(chǎn)具有重要意義。
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