★ 羅杠 馬興霞 尹小英*

（江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004）

多穗金粟蘭為金粟蘭屬植物（Choranthus multistachys Pei），又名四大天王、四塊瓦、四葉細(xì)辛，是重要草藥的一種，全草入藥，性味苦辛，微溫，有小毒，具有活血散瘀、祛風(fēng)解毒的功效，被《本草綱目》所收載[1]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，金粟蘭植物多具有抗菌抗腫瘤增強(qiáng)免疫抗病毒，抗?jié)?，?zhèn)痛，抗血小板聚集等活性[2]?，F(xiàn)在臨床用于治療跌打損傷、腰腿痛、疔腫、皮膚瘙癢等病癥[3]。其中主要的活性成分為倍半萜內(nèi)酯，目前已有単萜、倍半萜、二倍半萜及二萜報(bào)道[4]。為了充分提取倍半萜內(nèi)酯活性部位，本實(shí)驗(yàn)比較了滲漉法、浸漬法和加熱回流提取法，以浸膏得率和黨參內(nèi)酯含量為指標(biāo)得最佳提取工藝，為相關(guān)活性部位的提取提供參考。

1 材料

1.1 藥材

多穗金粟蘭，購(gòu)自江西樟樹(shù)，經(jīng)付小梅教授鑒定為多穗金粟蘭植物。陰干的多穗金粟蘭根粉碎成不同粒度的粉末，備用。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 1200），分析電子天平（北京賽多利斯），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）。

1.2.2 試劑 黨參內(nèi)酯標(biāo)對(duì)照品（上海融禾，100716），乙腈（色譜純，上海星可生化試劑公司），純凈水（娃哈哈，杭州娃哈哈集團(tuán)），甲醇（色譜純，上海星可生化試劑公司）、95%乙醇（分析純，天津恒興化學(xué)試劑公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法比較

2.1.1 加熱回流提取法 取20、60、100目的粉末藥材各10 g，用5、10、15倍量的95%的乙醇，提取時(shí)間為0.5、1、1.5h，分別提取3次，收集提取液，減壓濃縮干燥，得干浸膏，計(jì)算浸膏得率，測(cè)定黨參內(nèi)酯的含量，計(jì)算黨參內(nèi)酯得率。試驗(yàn)選用粒度大小、溶媒體積和時(shí)間三因素三水平，采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)?？疾煲蛩厮?、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表1-3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 黨參內(nèi)酯得率方差分析

從表3方差分析結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)提取無(wú)顯著性影響，據(jù)表2中極差值可知，對(duì)提取影響程度依次為：A＞B＞C。在提取過(guò)程中，溶媒的量會(huì)影響提取效率，故選B3，在加熱回流中，溫度不宜過(guò)高，否則破壞有效成分，故選C1。最佳提取的組合為A3B3C1，即100的多穗金粟蘭用15倍的95%的乙醇加熱回流30分鐘提取。

2.1.2 浸漬法 取20、60、100目的粉末藥材各10g，用8、10、12倍量的95%的乙醇，提取時(shí)間為5、7、9天，分別提取2次，測(cè)浸膏量及測(cè)定含量。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)同“2.2.1”?？疾煲蛩厮?、方案及結(jié)果和方差分析見(jiàn)表4-6。

表5 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表6 黨參內(nèi)酯得率方差分析

從表6方差分析表明3個(gè)因素均無(wú)顯著性差異。從表5極差值可知，影響因素的程度依次為：C＞A＞B。一般情況下，溶媒的量為藥材的10倍量，故選B2。不同大小顆粒有不同程度影響提取效率，故選A3。最佳的提取組合為：A3B2C3，即100目的多穗金粟蘭用10倍的95%的乙醇浸漬9d。

2.1.3 滲漉法 取20、60、100目的粉末藥材各10 g，用10、15、20倍體積量的95%的乙醇，以2、4、6mL/min?kg的流速，測(cè)浸膏量及測(cè)定含量。正交實(shí)驗(yàn)安排同“2.2.1”?？疾煲蛩睾退?、正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果和方差分析見(jiàn)表7-9。

表7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

表8 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表9 黨參內(nèi)酯得率方差分析

從表9方差分析和表8極差值表明在三個(gè)因素中，對(duì)黨參內(nèi)酯提取率的影響程度依次為：A＞B＞C。其中流速幾乎不影響，但從時(shí)間角度考慮，故選C2。最佳的提取組合為：A3B2C2。

從3種提取方法結(jié)果可知，滲漉法和加熱回流提取法效果最好，但在加熱過(guò)程中，會(huì)破壞部分有效成分，故選擇滲漉提取法，即用10倍量的95%的乙醇為溶劑，對(duì)100目的多穗金粟蘭粉末以4 mL?min-1?kg-1流速進(jìn)行滲漉。

2.2 黨參內(nèi)酯含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 依利特C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相梯度：乙腈：水（0 min：15%：85%，10 min：60%：40%，23 min68%：32%，33 min 76%：24%，38 min：85%：15%，50 min：100%：0%）；流速：1 mL/min；柱溫：30°；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 黨參內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱(chēng)取黨參內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，即得黨參內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 取1mg/mL黨參內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品1、2 mL分別置于5 mL的容量瓶中，再另取黨參內(nèi)酯100ug/mL 500μL、1mL、2mL置于5 mL的容量瓶中，用乙腈定容。在220nm處進(jìn)行高效液相檢測(cè)，做成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸分析得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程為：Y=54.47X-65.124，r=0.9999.

2.2.4 樣品黨參內(nèi)酯含量的測(cè)定 取樣品約0.6 g，配制成2 mg/mL的溶液，取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算黨參內(nèi)酯的含量。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取黨參內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品20 μg/mL的溶液，平行進(jìn)樣5次測(cè)其峰面積，其RSD值為3.1%。

3 討論

3.1 含量測(cè)定方法

倍半萜內(nèi)酯是多穗金粟蘭的主要成分之一，其中黨參內(nèi)酯具有較好的抗癌活性[5]，但含量較低，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道多穗金粟蘭中黨參內(nèi)酯的含量的含量測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)選用黨參內(nèi)酯為對(duì)照品，于220 nm處測(cè)定黨參內(nèi)酯含量，并以此作為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選最佳工藝，控制質(zhì)量是可行的。

3.2 提取方法比較

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，浸漬法提取效果較差，滲漉法和加熱回流提取法結(jié)果幾乎相同。在滲漉法提取中，存在濃度梯度差，加熱回流實(shí)驗(yàn)，高溫度有利于溶出。故后兩者的提取效果更好。

3.3 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)中采用了水-甲醇和水-乙腈溶劑系統(tǒng)，兩者都能得到很好的分離，但后者分離倍半萜內(nèi)酯成分吸收值更大，吸收峰更多，并且基線(xiàn)更平穩(wěn)。故選擇選水-乙腈溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

[1]李時(shí)珍.本草綱目[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1982，13：820.

[2]周伯庭.我國(guó)金粟蘭屬要用植物化學(xué)成分與藥理作用的研究進(jìn)展[J].中藥材，2004，27（27）：539-542.

[3]喻慶祿，晏天寶，羅永明.多穗金粟蘭的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2002，19（4）：327-328.

[4]冉新輝，倪偉，魏剛，等.多穗金粟蘭中一個(gè)新的酚苷[J].云南植物研究，2010，32（1）：83-86.

[5]Masaaki U，Yutaka K，Genjiro K，et al.Studies on the Constitutents of Chloranthus spp.III Six sesquiterpenes from Chloranthus japonicus[J].Chemical＆Pharmaceutical BμLletin，1980，28（1）：92-102.