金銀花中綠原酸的微波提取工藝研究

何 培，丁慧娟，劉芷成，劉 歡，申湘忠

(湖南人文科技學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系，湖南婁底417000)

金銀花又名忍冬花、銀花、雙花、茶葉花等，為忍冬科植物，是我國常用中藥，金銀花常用于治療溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰瘍等癥，亦用于風(fēng)熱感冒、支氣管炎等病癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，金銀花具有抗病原微生物、抗炎、抗生育、解熱、保肝、止血、降血脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，臨床主要用于治療多種感染、各種炎癥、高熱癥、高血脂癥、腫瘤放療等[2]。金銀花中富含多種對人體健康有益的營養(yǎng)物質(zhì)[3]，諸如綠原酸、異綠原酸、揮發(fā)油、咖啡酸、黃酮化合物、三萜皂苷、木犀草素及無機元素等，具有很高利用價值。金銀花的主要成分為綠原酸、類黃酮，而綠原酸是金銀花主要的抗菌成分，綠原酸含量的高低是目前衡量金銀花品質(zhì)優(yōu)劣的指標(biāo)之一[4]。提高金銀花制劑中綠原酸含量對保證金銀花制劑的藥效具有重要作用。

目前，綠原酸的提取多采用水煎煮、醇回流、動態(tài)浸提法、超聲波法和微波法等[5-10]。國內(nèi)外對綠原酸不同提取工藝的評價眾說紛紜，但是鑒于中國古老的煎藥方式，認(rèn)為水煎煮法對提取物藥有提取時間過長的缺點。近年來，微波在植物有效成分提取過程中的研究發(fā)展很快，由于微波具有穿透性和由內(nèi)向外的加熱方式等優(yōu)點，在現(xiàn)代活性成分提取中的運用越來越廣泛。為提高金銀花的利用率，結(jié)合現(xiàn)代提取方式[11-13]，本文采用微波預(yù)處理水浴加熱法進行金銀花中綠原酸的提取實驗，并使用紫外分光光度計測定綠原酸的濃度，運用正交試驗對較優(yōu)的提取方法進行了研究。并探討了乙醇濃度、提取時間、溫度、醇用量、水用量、微波處理時間等6個因素對提取金銀花中綠原酸含量的影響。通過正交實驗對金銀花中綠原酸的提取進行比較分析以確定金銀花中綠原酸的微波提取的最佳工藝。

一 實驗部分

(一)儀器和試劑

紫外可見分光光度計(UV-2501PC)，日本島津公司生產(chǎn);電子天平(FA2004A)，上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2)，江蘇金壇市億通電子有限公司生產(chǎn);微波爐(WD800)，長沙超揚電器貿(mào)易有限公司生產(chǎn);循環(huán)水式真空泵(SHZ-D)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);微型植物試樣粉碎機(XY-500A)，浙江永康壽松儀器有限公司生產(chǎn);綠原酸標(biāo)樣，長沙市有機試劑廠生產(chǎn);無水乙醇(AR)，衡陽市凱信化工試劑有限公司生產(chǎn);鹽酸(AR)，株洲石英化玻有限公司生產(chǎn)。

(二)實驗方法

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0．2500g，用蒸餾水定容至250ml容量瓶中，然后準(zhǔn)確量取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0ml，分別用蒸餾水定容至50ml容量瓶，將溶液搖勻后配成各種標(biāo)準(zhǔn)濃度，用蒸餾水做參比液，采用UV-2501紫外可見分光光度計進掃描，確定綠原酸最大吸收波長。在最大吸收波長下測定不同濃度的綠原酸的吸光度。

2．金銀花中綠原酸的提取

將100g市售金銀花洗凈，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥時間為24h。將干燥好的金銀花用微型植物試樣粉碎機粉碎，直至過55目篩，保存在試劑瓶中，稱取2．0g預(yù)處理好的金銀花粉末置于100ml燒杯中，邊滴乙醇溶液邊攪拌使之濕潤均勻，然后鋪平靜置10min，使溶液充分滲入金銀花組織內(nèi)。向預(yù)處理好的金銀花粉末中加水，恒溫提取，將提取液抽濾。將濾液加水定容到250ml的容量瓶中定容，再量取2ml的溶液加水定容到50ml的容量瓶中，然后在設(shè)定波長下測定吸光度及濃度。

(三)單因素實驗

1．微波預(yù)處理時間對綠原酸濃度的影響

在固定其它因素(乙醇濃度、乙醇用量、浸提水用量、浸提時間、浸提溫度)的條件下，分別在微波爐中對金銀花粉末處理 40s、50s、60s、70s和80s，然后水浴加熱，提取液定容，分別測定吸光度及濃度。

2．乙醇濃度對綠原酸濃度的影響

在固定其它因素條件下，分別使用60%、70%、80%、90%和95%的乙醇對金銀花粉末進行預(yù)處理，然后水浴加熱，提取液定容，測定吸光度及濃度。

3．乙醇用量對綠原酸濃度的影響

在固定其它因素的條件下，分別采用2、3、4、5和6倍量的乙醇對金銀花粉末進行處理，然后水浴加熱，提取液定容，測定吸光度及濃度。

4．浸提水用量對綠原酸濃度的影響

在固定其他因素的條件下，分別采用10、15、20、25和30倍的水量進行水浴浸提，提取液定容，測定吸光度以及濃度。

5．浸提時間對綠原酸濃度的影響

在固定其他因素的條件下，分別采用40min、50min、60min、70min和80min的水浴時間進行浸提，提取液定容，測定吸光度及濃度。

6．浸提溫度對綠原酸濃度的影響

在固定其他因素的條件下，分別采用50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的水浴溫度進行浸提，提取液定容，測定吸光度及濃度。

(四)正交實驗

1．微波預(yù)處理條件的正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，固定浸提條件，對預(yù)處理的3個因素(乙醇濃度、乙醇用量、微波預(yù)處理時間)各取3個水平，進行L9(33)正交實驗(表1)，以綠原酸濃度作為指標(biāo)進行考察。

表1 微波預(yù)處理因素水平表

2． 浸提條件的正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，固定微波預(yù)處理條件，對浸提實驗的3個因素(浸提時間、浸提水用量、水浴溫度)各取3個水平，進行L9(33)正交實驗(表2)，以綠原酸濃度作為指標(biāo)進行考察。

表2 浸提條件因素水平表

二 結(jié)果與分析

(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的掃描見圖1，可以看出綠原酸的最大吸收波長在324．0nm處。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外掃描圖

以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回歸方程Y=AX+B

式中:A=0．0525 B=-0．0022

X—綠原酸的濃度(μg/ml)，Y—吸光度，R2=0．9999，說明綠原酸濃度在 0-20 μg/ml范圍內(nèi)，吸光度與綠原酸濃度的線性關(guān)系良好。

(二)單因素實驗結(jié)果與分析

1．微波預(yù)處理時間對綠原酸提取的影響

不同微波預(yù)處理時間對綠原酸提取的影響見圖3。

圖3 微波預(yù)處理時間對綠原酸提取的影響

從圖3可以看出，當(dāng)微波預(yù)處理時間為60s時，綠原酸的濃度最高，提取效果最好。小于60s時，處理時間太短，滲透到細胞的乙醇不能完全汽化，組織破壞不完全;大于60s時，會破壞細胞結(jié)構(gòu)，影響綠原酸的產(chǎn)量。

2．乙醇濃度對綠原酸提取的影響

用不同乙醇濃度對金銀花進行處理，不同濃度乙醇對綠原酸提取的影響見圖4。

圖4 乙醇濃度對綠原酸提取的影響

由于不同濃度的乙醇溶液對金銀花細胞膜的滲透效果是不同的，滲透細胞膜效果越好，微波對細胞組織的破壞效果越好，綠原酸的產(chǎn)量也就越好。從圖4可以看出，用濃度為80%的乙醇溶液處理金銀花，得到的綠原酸濃度最高，由此也可以看出濃度為80%的乙醇溶液對金銀花細胞膜的滲透效果最好。

3．乙醇用量對綠原酸提取的影響

用不同用量的同濃度乙醇溶液對金銀花進行處理，實驗結(jié)果見圖5。

圖5 乙醇用量對綠原酸提取的影響

當(dāng)乙醇用量少時，金銀花粉末沒有很好地被浸濕，不能達到很好的處理效果;當(dāng)乙醇用量過多時，過多的乙醇在蒸發(fā)時會消耗一定的微波能，使?jié)B透入細胞內(nèi)的乙醇溶液揮發(fā)不夠充分，從而影響綠原酸的提取。從圖5可以看出，當(dāng)乙醇用量為5倍量時，綠原酸的濃度最高，所以用5倍量的乙醇提取效果會更好。

4．浸提水用量對綠原酸提取的影響

不同浸提水用量對綠原酸提取的影響見圖6。

圖6 浸提水用量對綠原酸提取的影響

在一般的提取實驗中，加大溶劑的用量可以提高提取率。但是綠原酸比較特殊，在加水的過程中，PH會慢慢增加，會有部分的綠原酸分解，從而影響綠原酸的提取率。從圖6可以看出，當(dāng)提取水的用量為15倍量時，綠原酸的濃度最高，綠原酸提取的效果最好。

5．浸提時間對綠原酸提取的影響

浸提時間對于綠原酸的提取有一定的影響，浸提時間對綠原酸提取的影響見圖7。

圖7 浸提時間對綠原酸提取的影響

浸提時間與綠原酸在水中的溶解度有關(guān)，當(dāng)綠原酸的溶解度達到飽和時，延長浸提時間不會增加綠原酸的濃度，反而綠原酸在光照下會有部分的分解，隨著時間的增加，綠原酸的濃度會慢慢降低。從圖7可以看出，當(dāng)浸提時間小于60min時，綠原酸的濃度不斷提高，到60min時達到最優(yōu)，大于60min后則會有部分綠原酸分解而使綠原酸濃度慢慢降低。

6．浸提溫度對綠原酸提取的影響

不同浸提溫度對綠原酸提取的影響見圖8。

圖8 浸提溫度對綠原酸提取的影響

升高浸提溫度，可以提高分子的熱運動，從而提高綠原酸的提取效率。但是綠原酸的性質(zhì)表明:溫度過高時，綠原酸容易分解。從圖8可以看出，當(dāng)浸提溫度小于70℃時，升高溫度有利于綠原酸的提取，綠原酸的濃度在不斷上升;當(dāng)浸提溫度為70℃時，綠原酸的濃度達到最大值;當(dāng)浸提溫度大于70℃時，綠原酸的濃度在不斷減小，說明綠原酸在不斷地分解。實驗得出綠原酸的最優(yōu)浸提溫度為70℃。

(三)正交實驗結(jié)果與分析

1．微波預(yù)處理實驗的正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取預(yù)處理中影響綠原酸提取的3個因素(微波預(yù)處理時間、乙醇濃度和乙醇用量)進行3因素3水平正交實驗。實驗結(jié)果見表3。

由表3中R值的大小可以看出，在金銀花中綠原酸微波提取的預(yù)處理實驗部分，影響最大的條件為C(乙醇用量)，其次是A(乙醇濃度)，最后是B(微波預(yù)處理時間)。對K值進行分析，得出最優(yōu)的微波預(yù)處理實驗組合為A2B2C1，即乙醇濃度為80%，微波預(yù)處理時間60s，乙醇用量為4倍量。

表3 微波預(yù)處理正交實驗表

2．浸提條件的正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對浸提條件中影響綠原酸提取的3個因素(浸提溫度、浸提時間和浸提水用量)進行3因素3水平的正交實驗。實驗結(jié)果見表4。

表4 浸提條件正交實驗表

由表4中R值的大小可以看出，在金銀花中綠原酸的微波提取實驗的浸提實驗部分，影響最大的條件為D(浸提水用量)，其次為E(浸提水浴溫度)，最后是F(浸提時間)。對K值進行分析，得出最優(yōu)的浸提實驗組合為D2E2F1，即浸提水用量為 15倍，浸提水浴溫度為 70℃，浸提時間為50min。

3．最優(yōu)條件的驗證實驗

根據(jù)對微波預(yù)處理條件的正交實驗和浸提條件的正交實驗，可以得出金銀花中綠原酸的微波提取實驗最佳的條件為:加入4倍量80%的乙醇溶液，微波預(yù)處理60s，然后加15倍量的蒸餾水在70℃的水浴溫度中提取50min，并進行綠原酸的微波提取實驗，得到綠原酸濃度為16．6758 mg·L-1，綠原酸的含量為8．34mg·g-1。

三 結(jié)論

用微波預(yù)處理水浴浸提法對金銀花中的綠原酸進行提取，用紫外可見分光光度計進行結(jié)果測量，通過對預(yù)處理實驗中的3個因素和浸提實驗中的3個因素進行研究，確定了微波法提取綠原酸的最佳條件:4倍量80%的乙醇、微波預(yù)處理60s、15倍量的蒸餾水、水浴溫度為70℃、浸提時間為50min。在此最佳條件下進行提取實驗，提取得到的綠原酸含量為8．34mg·g-1。采用微波預(yù)處理法提取金銀花中的綠原酸比傳統(tǒng)提取的方法得到的綠原酸的含量要高。實驗得到的工藝可供工業(yè)生產(chǎn)作為參考。

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