羅君琴，徐建國，王 平，柯甫志，聶振朋

(浙江省柑橘研究所，浙江 黃巖 318020)

花藥離體培養(yǎng)技術(shù)在作物育種和遺傳進(jìn)化研究中具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值，利用該技術(shù)可獲得一定比例的單倍體或異倍體材料，有助于在短期內(nèi)創(chuàng)造新的不同基因型的遺傳材料，豐富作物育種原始種質(zhì)資源，有助于縮短育種進(jìn)程［1-11］。

本研究選擇柑橘單核中晚期花藥為離體培養(yǎng)外植體［7-8］，通過比較不同柑橘品種［2］、培養(yǎng)基外源激素配方［3，8-9，12-15］、外植體低溫預(yù)處理［3，7-8，12］等因子對花藥離體愈傷誘導(dǎo)的影響，研究柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)及無菌再生體系的建立，以期為今后全面開展柑橘花藥 (花粉)離體培養(yǎng)奠定一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以浙江省柑橘研究所山地試驗(yàn)站品種資源圃及本部試驗(yàn)場的北京檸檬 (Citrus limon Burm.f.)、439桔橙 (reticulata× sinensis)、早桔 (Citrus compressa Tanaka)、四季桔 (madurensis Lour.)和長壽金柑(Fortunella obovata Tanaka)5個(gè)柑橘品種為試材，以柑橘現(xiàn)蕾期花粉處于單核中晚期時(shí)的幼花蕾花藥為離體培養(yǎng)對象。

1.2 外植體消毒

先將柑橘幼花蕾在洗滌劑中浸泡15～30 min，流水沖洗20～30 min，在無菌條件下，將花蕾進(jìn)行75%乙醇10～15 s+0.1% 升汞10 min 滅菌處理，無菌水沖洗3～5 次后，在體視顯微鏡下切除花絲，小心切取花藥接種到各誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種時(shí)注意避免花柱、花冠、子房等其他組織器官混入。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 不同柑橘品種花藥離體愈傷誘導(dǎo)比較

試驗(yàn)比較北京檸檬等5種柑橘花藥在相同培養(yǎng)條件下離體愈傷誘導(dǎo)效果。每個(gè)品種離體接種500個(gè)以上花藥，花藥接種后每隔1 周觀察愈傷形成情況，記錄各品種花藥最早愈傷出現(xiàn)時(shí)間，3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生愈傷接種外植體比例。

1.3.2 外源激素對柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

以MT 基本培養(yǎng)基中添加6-BA，TDZ，2，4-D為考查因子，利用正交設(shè)計(jì)篩選花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基外源激素配方。試驗(yàn)以北京檸檬花藥為接種外植體，采用L9(33)正交方案，設(shè)9個(gè)處理組合，每個(gè)處理組合接種400～500個(gè)花藥，培養(yǎng)3個(gè)月后，觀察記錄花藥愈傷誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計(jì)分析外源激素對花藥愈傷誘導(dǎo)的影響。

1.3.3 低溫預(yù)處理對柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

柑橘花藥外植體接種于相同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先分別在 (6 ± 2)℃低溫暗培養(yǎng)0，5，10，15，20 d，再轉(zhuǎn)入23～25℃條件暗培養(yǎng)。每處理400～500個(gè)花藥，3個(gè)月后觀察統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生愈傷外植體比例。以上各處理基本培養(yǎng)基均為MT+30～40 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂，pH 值5.8，培養(yǎng)溫度無特指均為23～25℃，光照條件為愈傷產(chǎn)生前為暗培養(yǎng)，愈傷形成后在2 000～2 500 lx 下12 h·d-1光培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同柑橘品種花藥離體愈傷誘導(dǎo)比較

從表1 可知，北京檸檬花藥愈傷較易誘導(dǎo)，花藥愈傷最初產(chǎn)生所需時(shí)間在5個(gè)柑橘品種中最短，5 周即肉眼可見愈傷產(chǎn)生，接種后花藥產(chǎn)生愈傷外植體比例極顯著高于其他幾種，高達(dá)69.97%。439 桔橙、長壽金柑、四季桔花藥愈傷誘導(dǎo)較難，花藥接種3個(gè)月后外植體愈傷比率僅分別為1.90%，0.33%和0.20%。早桔接種后3個(gè)月內(nèi)未能獲得花藥愈傷，接種23 周后才有愈傷產(chǎn)生，其花藥愈傷誘導(dǎo)在5個(gè)供試品種中最難。柑橘花藥離體接種及所獲誘導(dǎo)愈傷的部分組培圖片如圖1所示。

表1 5個(gè)柑橘品種花藥離體愈傷誘導(dǎo)

2.2 不同外源激素對柑橘花藥愈傷的誘導(dǎo)

圖1 幾種花藥離體培養(yǎng)形成的愈傷組織

北京檸檬花藥離體培養(yǎng)3個(gè)月后，觀察比較各處理培養(yǎng)基對花藥愈傷誘導(dǎo)的影響 (表2)。對6-BA，TDZ 和2，4-D 3個(gè)水平、9個(gè)組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析表明，3種外源激素對花藥愈傷誘導(dǎo)的影響作用依次為2，4-D ＞TDZ ＞6-BA;對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析表明，2，4-D (F=10.34)，TDZ (F=1.63)，6-BA (F=0.29)等因子對北京檸檬花藥愈傷誘導(dǎo)影響均未達(dá)顯著水平。結(jié)合表2直觀分析，試驗(yàn)可優(yōu)選處理2 組合培養(yǎng)基用于柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)。

表2 外源激素對北京檸檬花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

2.3 低溫預(yù)處理對柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

北京檸檬、439 桔橙花藥接種前分別在 (6 ±2)℃低溫暗培養(yǎng)0，5，10，15，20 d，各處理花藥接種3個(gè)月后，進(jìn)行外植體產(chǎn)生愈傷比例觀察(圖2)。

圖2 低溫預(yù)處理時(shí)間對柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的影響

由圖2 可知，2種柑橘在 (6 ±2)℃低溫預(yù)處理5～10 d，花藥外植體愈傷誘導(dǎo)比率均高于未低溫預(yù)處理及低溫預(yù)處理超過15 d 的處理。適當(dāng)時(shí)長的低溫預(yù)處理有助于柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)。

3 小結(jié)和討論

相同誘導(dǎo)培養(yǎng)基和光溫控制條件下，5個(gè)供試柑橘品種花藥愈傷誘導(dǎo)差異很大，一定程度上反映出柑橘花藥誘導(dǎo)受各品種不同的遺傳因子直接影響。品種選擇是柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)成敗的關(guān)鍵。結(jié)合鄭振光等［8］的柑橘花藥培養(yǎng)研究表明，檸檬類、橙類花藥的離體愈傷誘導(dǎo)相對較易，寬皮柑橘類栽培品種花藥愈傷誘導(dǎo)較難。試驗(yàn)中的長壽金柑、四季桔均是金柑與寬皮柑橘的雜種后代，兩品種的花藥離體愈傷最初產(chǎn)生所需時(shí)間及花藥接種3個(gè)月后的外植體愈傷比例很接近，這也反映出遺傳基因決定柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)難易程度。

外源激素是影響花藥離體培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。不同果樹對不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度的反應(yīng)不同，需在試驗(yàn)中找到各自適合的組合配方。目前國內(nèi)外有關(guān)柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)技術(shù)報(bào)道相對較少，可直接借鑒的培養(yǎng)基配方技術(shù)參數(shù)相關(guān)資料更少。利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基激素組合，可快速有效地篩選、判斷培養(yǎng)基添加適用外源激素種類及濃度范圍。2，4-D，TDZ和BA 是植物組培中愈傷誘導(dǎo)的重要添加激素［8，13，15］，細(xì)胞分裂素/生長素比值及絕對濃度 控制接種外植體的脫分化及再分化形態(tài)建成的方向，直接影響花藥外植體愈傷誘導(dǎo)結(jié)果。本研究通過正交試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，6-BA，TDZ，2，4-D 3種生長調(diào)節(jié)劑對供試柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)的影響主次順序?yàn)?，4-D ＞TDZ ＞6-BA，(BA+TDZ)/2，4-D 比值在3～4∶1 范圍內(nèi)可較大程度地促進(jìn)柑橘花藥離體愈傷誘導(dǎo)。更易促進(jìn)柑橘花藥愈傷誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素/生長素比值是否也在該范圍內(nèi)，有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

柑橘花藥接種前期在 (6 ±2)℃低溫預(yù)培養(yǎng)5～10 d 有利于柑橘花藥離體培養(yǎng)后的愈傷誘導(dǎo)。本試驗(yàn)結(jié)果與陳力耕等［7-8，12］適當(dāng)時(shí)長的低溫預(yù)處理促進(jìn)花藥愈傷誘導(dǎo)的研究結(jié)果一致。目前針對不同作物物種花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)各實(shí)驗(yàn)室所采用的低溫預(yù)處理絕對溫度不盡相同，宜根據(jù)不同低溫試驗(yàn)獲取各自的適宜處理時(shí)長。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)低溫預(yù)處理的對照組檸檬花藥外植體誘導(dǎo)率仍可達(dá)48.1%，一定程度上說明低溫預(yù)處理非花藥愈傷誘導(dǎo)必不可少的決定性技術(shù)因子。低溫預(yù)處理促成愈傷組織形成，可能與其在不影響花藥內(nèi)花粉正常生長前提下，延緩離體培養(yǎng)的花藥熟化，為花藥吸收外源激素盡快促成生殖生長向營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變有關(guān)。

目前實(shí)驗(yàn)室已成功誘導(dǎo)獲取北京檸檬、439 桔橙、四季桔等4個(gè)柑橘品種花藥愈傷組織，并根據(jù)愈傷發(fā)生部位不同，分類繼代增殖及保存，下階段可進(jìn)一步開展愈傷材料倍性檢測、胚狀體或再生芽誘導(dǎo)等試驗(yàn)研究。

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