新型麥芽四糖酶及其應(yīng)用

錢 瑩， 段 鋼

（杰能科（中國）生物工程有限公司，江蘇 無錫214028）

隨著人們對健康意識的逐步提高，含有大量高甜度，高熱量糖漿的食品正被越來越多的消費者所拋棄，進(jìn)而轉(zhuǎn)向具有溫和的甜度，較低的熱量以及較高營養(yǎng)功效的食物。近年來發(fā)達(dá)國家對麥芽低聚糖的研究，因其顯著的保健功能，麥芽低聚糖已被做為一種“功能性食品”被人們所接受[1]。

麥芽四糖是麥芽低聚糖家族中的一員，由4個葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵連接而成。麥芽四糖的甜度只有蔗糖甜度的20%，但其粘度卻為蔗糖的2～5倍。麥芽四糖具有很好的保濕性，而且其低含量的葡萄糖與麥芽糖使得美拉德反應(yīng)不容易發(fā)生。麥芽四糖具有低滲透壓及耐酸、耐熱等特性，因此其在食品行業(yè)中的應(yīng)用頗廣[2]。麥芽四糖還由于其良好的成膜性而做為施膠劑用于造紙行業(yè)以及其與可溶淀粉相似性用于生化試劑分析行業(yè)[3]。麥芽四糖有諸多保健功能，如可抑制腸內(nèi)腐敗菌的增殖，改善腸內(nèi)環(huán)境；促進(jìn)人體對鈣的吸收等[3]。鑒于麥芽四糖的眾多特性，日本學(xué)者Nakakuki稱其為最有希望的麥芽低聚糖[4]。

麥芽四糖糖漿一般是由淀粉經(jīng)過酶解而制得。淀粉先在液化酶的作用下轉(zhuǎn)化成可溶性糊精，再由麥芽四糖酶水解，將長鏈的糊精降解為以麥芽四糖為主的小分子糖，最后經(jīng)過分離純化制成麥芽四糖糖漿。目前研究報道的麥芽四糖淀粉酶主要來源于Pesudomonasstutzeri，Bacillus.circulans，Bacillussubtilis和Pesudomonas saccharophilia，其中大部分酶的pH使用范圍集中在中性及偏堿性，體系的反應(yīng)溫度也不能高于60℃，但是在相對較低的溫度及高pH值的操作條件下，很容易造成系統(tǒng)染菌及糖液顏色變深，這對實際生產(chǎn)操作會造成很大的難度[6-12]。另外麥芽四糖酶的生產(chǎn)成本是另一個限制其商業(yè)化大規(guī)模使用的原因。

作者使用了一種新型的從Pesudomonas saccharophilia基因修飾而得到的麥芽四糖酶，該酶不僅具有一般淀粉酶的內(nèi)切性質(zhì)，能夠快速降低糊精的粘度，同時還具有外切酶的性質(zhì)，產(chǎn)生大量的麥芽四糖。通過對其生產(chǎn)麥芽四糖糖漿工藝的研究以及優(yōu)化，使其可以更加高效率更加方便的用于實際生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米商品淀粉：山東諸城興茂公司產(chǎn)品；液化酶 Spezyme Fred，麥芽四糖酶 Optimal 4G，普魯蘭酶Optimax L-1000：杰能科公司產(chǎn)品，單糖，雙糖，三糖及四糖標(biāo)準(zhǔn)品：色譜級。

1.2 實驗儀器

快速水分測定儀：MA 30，德國Sartorius公司產(chǎn)品；電子恒溫水浴鍋：美國Fisher公司產(chǎn)品；電子天平：PL4002，瑞士Mettler公司產(chǎn)品；阿貝折光儀：RE40D，瑞士Mettler公司產(chǎn)品；高效液相色譜：HPLC，美國Agilent公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程 配料→調(diào)pH，加酶→噴射液化→維持→冷卻，調(diào)pH→糖化

1.3.2 高效液相色譜分析 示差折光檢測器，分離柱：Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid column；柱溫：60℃；流動相：0.005 mol/L硫酸；流量：0.6 mL/min，分析在常溫下進(jìn)行15 min。

圖1 麥芽四糖的色譜分離圖譜Fig.1 HPLC of maltotetraose

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對麥芽四糖酶的影響

以淀粉液化液做為底物，麥芽四糖酶在不同pH的反應(yīng)體系中產(chǎn)生的麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖2所示。

圖2 麥芽四糖酶在不同pH值條件下對麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of system pH on maltotetraose-forming amylase performance

從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糖液起始pH為4.0時，24 h的麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)就能夠達(dá)到44.5%以上。隨著pH的上升，麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷升高，當(dāng)pH達(dá)到5.0～5.5時，麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高點，而后麥芽四糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著pH的升高后回落，但總的來講，麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不是特別大。這說明該麥芽四糖酶的使用pH范圍很廣，這與以前報道過的麥芽四糖酶需在中性及偏堿性條件下才能發(fā)揮作用有很大不同。該酶能在偏酸的條件下發(fā)揮最佳作用對實際生產(chǎn)非常有利的，因為淀粉乳液化的pH值通?？刂圃趐H5.2～5.8，如果糖化單元也可以在此pH范圍內(nèi)操作，則可省去調(diào)節(jié)pH的步驟，非常方便。

2.2 溫度對麥芽四糖酶的影響

以淀粉液化液做為底物，麥芽四糖酶在不同溫度的反應(yīng)體系中產(chǎn)生的麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖3所示。

圖3 麥芽四糖酶在不同溫度下對麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on maltotetraoseforming amylase performance

從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃時，24 h的麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)就能夠達(dá)到44%以上。隨著溫度的上升，反應(yīng)速度加快，麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷升高，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時，麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高點，而后麥芽四糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著溫度的升高而回落。當(dāng)反應(yīng)溫度在70℃時麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然有44%。這說明此麥芽四糖酶的使用溫度范圍很廣，這與以前報道過的麥芽四糖酶在60℃已失活過半相比有很大不同[12]。反應(yīng)體系的溫度升高，可以加快酶促反應(yīng)的速度，同時反應(yīng)在較高溫度下操作，還可以降低微生物染菌的可能，從而避免了目標(biāo)產(chǎn)物的損失。

2.3 底物液化DE值對麥芽四糖酶的影響

在麥芽糖的生產(chǎn)過程中，底物液化液的水解程度對最終產(chǎn)物麥芽糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較大。底物液化液的水解程度過高，即液化液的DE值過高，麥芽糖的最終產(chǎn)率將越低。那么在麥芽四糖的生產(chǎn)過程中，是否液化液的水解程度對其最終濃度也有影響。將不同DE值的麥芽糊精做為底物，對最終的麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)做了比較（圖4）。通過對比發(fā)現(xiàn)，液化液DE值的高低對麥芽四糖的最終產(chǎn)率也有著與麥芽糖生產(chǎn)相似的趨勢，隨著液化液的DE值的升高，麥芽四糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低。當(dāng)?shù)孜镆夯篋E分析其原因可能是因為液化液的DE值越高，表明液化液體系內(nèi)的糊精的分子鏈越短，特別是葡萄糖，麥芽糖等小分子的含量越高，造成麥芽四糖酶與目標(biāo)底物的結(jié)合就越困難，因此對底物的水解越不利，從而造成麥芽四糖的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高。

圖4.不同底物的水解程度對麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 EffectofdifferentliquefactDEonmaltotetraoseyield

2.4 普魯蘭酶與麥芽四糖酶的協(xié)同作用

普魯蘭酶是一種能夠水解淀粉中的α-1，6糖苷鍵產(chǎn)生直鏈糊精的脫枝酶。在淀粉糖生產(chǎn)中，由于液化酶與糖化酶水解支鏈淀粉的速度非常的緩慢，因此在糖化過程中，添加普魯蘭酶與糖化酶共同使用提高淀粉糖的產(chǎn)率。圖5顯示了不同計量的普魯蘭酶對麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。普魯蘭酶與麥芽四糖酶的協(xié)同作用效果明顯。當(dāng)普魯蘭酶的添加量為100 g/t時，麥芽四糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了不到1%，但是普魯蘭酶的添加量升高至500 g/t，麥芽四糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)已經(jīng)由原來的45.7%升到48.3%。普魯蘭酶的計量繼續(xù)調(diào)高到1 000 g/t，麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高并不明顯，這說明普魯蘭酶的添加量500 g/t以足夠。

圖5 麥芽四糖酶與不同普魯蘭酶協(xié)同作用對麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effect of additional pululanase working with maltotetraose-forming amylase on maltotetraose yield

2.5 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對麥芽四糖酶的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶促反應(yīng)有著較大的影響，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時，反應(yīng)速度會隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加。但是當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定程度，酶促反應(yīng)速度的增加會放緩。但是從節(jié)能及設(shè)備利用率的角度，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高是有利的。因此如何控制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在最佳范圍對目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率有著實際的意義。從圖6可知，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%時，麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以在50%以上，而當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到32%時，麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)已經(jīng)降至到48%左右。

圖6 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 Effect of different substance concentration on maltotetraose yield

3 結(jié)語

通過對麥芽四糖酶的反應(yīng)pH、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及與普魯蘭酶的協(xié)同作用的研究發(fā)現(xiàn)，新型的麥芽四糖酶可以在pH 4.0～7.0比較寬泛的條件下發(fā)生作用，麥芽四糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均可達(dá)42%以上，其最佳pH范圍在5.0～5.5之間，這與之前報道的大部分麥芽四糖酶需在偏中性或堿性條件下反應(yīng)有很大的不同。由于淀粉的液化單元pH多控制在5.2～5.8，如果麥芽四糖酶反應(yīng)過程也可以控制在此范圍內(nèi)，則對生產(chǎn)操作非常有利，因為無需調(diào)節(jié)pH，這不僅節(jié)約了堿的用量，降低生產(chǎn)成本，同時也避免了大量離子的存在，減輕了后序的糖液離子交換環(huán)節(jié)的壓力。對于反應(yīng)溫度，新型的麥芽四糖酶可以在60～65℃下進(jìn)行反應(yīng)，在此溫度下操作，可以降低微生物染菌的可能，從而避免目標(biāo)產(chǎn)物的損失。研究還表明普魯蘭酶與麥芽四糖酶的協(xié)同作用效果明顯，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不易過高，20%～30%即可。

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