劉 飛,刁夢(mèng)奇,張金華,張林軍,袁 超,王鳳山,凌沛學(xué)
(1.山東大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250012;2.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 博士后科研工作站,山東 濟(jì)南 250101;3.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司,山東 濟(jì)南 250101)
普魯蘭糖是由出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖,又稱普魯蘭多糖、短梗霉多糖、茁霉多糖等。Bernier最先將普魯蘭糖分離并解析其結(jié)構(gòu)[1],后將其命名為“普魯蘭糖”[2]。當(dāng)前對(duì)普魯蘭糖的研究大多是圍繞其應(yīng)用與篩選,而有關(guān)普魯蘭糖分子合成途徑及分子量調(diào)控方面的研究較少。
研究發(fā)現(xiàn)[3-4]普魯蘭糖是α-1,4糖苷鍵連接的麥芽三糖重復(fù)單位通過α-1,6糖苷鍵聚合而成的直鏈狀多糖(圖1),分子量范圍2×104~2×106,分子量受到菌種及培養(yǎng)條件等多重因素影響[5-6]。普魯蘭糖是一種非離子型、非吸濕性的聚合物,具有良好的可塑性、穩(wěn)定性、成膜性和安全性,其黏度相對(duì)低于其他聚合物[7]。由于這些獨(dú)特的性質(zhì),普魯蘭糖在食品、藥物和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用[8-11]。
圖1 普魯蘭糖的基本結(jié)構(gòu)
目前,有關(guān)普魯蘭糖合成的具體分子機(jī)制尚未完全清楚。在普魯蘭糖的生物合成過程中約有5種酶參與(表1),尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDPG-焦磷酸化酶)、α-磷酸葡萄糖變位酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶被認(rèn)為是其中的關(guān)鍵酶[12]。從碳源開始至最后產(chǎn)生普魯蘭糖,可將其分為三大關(guān)鍵步驟。
2.1.1 從碳源初始底物到UDPG 出芽短梗霉利用碳源合成普魯蘭糖,Duan等[13]研究發(fā)現(xiàn),雖然普魯蘭糖合成可利用多種碳源,如甘露糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、半乳糖、木糖等,但在同等條件下,當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí),普魯蘭糖的產(chǎn)量最大。在轉(zhuǎn)化過程中,己糖激酶等負(fù)責(zé)將碳源轉(zhuǎn)化為6-磷酸-葡萄糖,α-磷酸葡萄糖變位酶催化6-磷酸-葡萄糖形成1-磷酸-葡萄糖[13]。普魯蘭糖前體UDP-葡萄糖是由UDPG-焦磷酸化酶將1-磷酸葡萄糖和UDP催化為UDP-葡萄糖和焦磷酸(pyrophosphoric acid,PPi),Shingel等[14]研究表明,UDPG不能由ADPG(adenosine diphosphate glucose)取代,表明普魯蘭糖起源于UDPG,在此反應(yīng)中,ATP(adenosinetriphosphate)和NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)作為輔助因子是必需的[13-14]。UDP-葡萄糖是普魯蘭糖合成的重要前體[14]。
表1 普魯蘭糖合成過程中相關(guān)酶
2.1.2 從UDPG到異麥芽糖 Shingel等[14]研究表明,含葡萄糖的脂質(zhì)中間體在普魯蘭糖的形成中起著至關(guān)重要的作用:首先UDP-葡萄糖介導(dǎo)的D-葡萄糖殘基通過磷酸酯橋連接到脂質(zhì)分子(lipid molecule,LPh)上,進(jìn)一步添加UDP-葡萄糖的D-葡萄糖殘基,得到脂質(zhì)連接的異麥芽糖;接下來,異麥芽糖基與脂質(zhì)連接的葡萄糖參與反應(yīng),生成異戊?;鶜埢愇祯;鶜埢删酆系狡蒸斕m糖鏈中。Hayashi等[15]研究表明葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在從麥芽糖(Glc-α-1→4-Glc)產(chǎn)生潘糖(Glc-α-1→6-Glc-α-1→4Glc)及異麥芽糖(Glc-α-1→6-Glc)中發(fā)揮重要功能。同時(shí)Duan等[13]研究表明,葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性水平越高,普魯蘭糖的產(chǎn)量越高,但其發(fā)揮功能具體機(jī)制尚不明確。
2.1.3 從異麥芽糖到普魯蘭糖鏈 有文獻(xiàn)報(bào)道,從異麥芽糖形成普魯蘭糖鏈的過程是在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下完成的[12,16]。但是,Kang等[17]構(gòu)建了破壞普魯蘭合酶基因的突變菌株,發(fā)現(xiàn)其可產(chǎn)生純的β-葡聚糖胞外多糖,而不能產(chǎn)生普魯蘭糖。Chi等[18]也發(fā)現(xiàn)破壞菌株中的普魯蘭合成酶可降低普魯蘭糖產(chǎn)量,暗示在從異麥芽糖形成過程中也可能是普魯蘭合酶在發(fā)揮作用[4]。
已知己糖激酶、UDPG-焦磷酸化酶、α-磷酸葡萄糖變位酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、普魯蘭合酶在普魯蘭糖的形成過程中有重要功能,本文研究人員根據(jù)文獻(xiàn)繪制了普魯蘭糖的合成途徑(見圖2):己糖激酶催化葡萄糖形成葡萄糖-6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸通過-磷酸葡萄糖變位酶形成葡萄糖-1-磷酸;葡萄糖-1-磷酸在UDPG-焦磷酸化酶作用下生產(chǎn)二磷酸尿苷葡糖;然后通過葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶與脂質(zhì)體生產(chǎn)連接脂質(zhì)的葡萄糖;連接脂質(zhì)的葡萄糖通過葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和普魯蘭合酶最終形成普魯蘭糖。但其具體作用機(jī)制尚未得到明確的闡釋,這也為下一步的研究提供了目標(biāo)。只有明確其作用機(jī)制,才能有針對(duì)性地控制菌種和產(chǎn)量等,更好地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和科研工作。
圖2 普魯蘭糖合成途徑
2.1.4 其他酶及化合物對(duì)普魯蘭糖合成的影響 除上述參與合成的酶外,其他酶及物質(zhì)也會(huì)影響普魯蘭糖的合成。郭建等[19]發(fā)現(xiàn),整合過表達(dá)載脂蛋白基因apo或gltP能增加多糖產(chǎn)量,而敲除apo或gltP則使多糖產(chǎn)量降低。作者推測(cè)可能因?yàn)閍po和gltP調(diào)控脂類物質(zhì)合成,影響普魯蘭糖合成所需基本單元糖脂中間體lipid-葡萄糖生成,或是導(dǎo)致某些脂類物質(zhì)作為反式作用因子強(qiáng)化了UDPG合成,導(dǎo)致磷酸葡萄糖變位酶、UDPG焦磷酸化酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的酶的活性增加,最終影響普魯蘭糖合成。研究[20-21]出芽短梗霉菌株中過表達(dá)透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscillahemoglobin,VHb)和黃素血紅蛋白(flavohemoglobin,F(xiàn)HB),發(fā)現(xiàn)菌株攜氧能力明顯增強(qiáng),負(fù)責(zé)葡萄糖運(yùn)輸、糖酵解、NADH代謝、ATP產(chǎn)生等基因的轉(zhuǎn)錄水平提高,顯著提高了普魯蘭糖產(chǎn)量。可能因?yàn)槠蒸斕m糖的合成是一個(gè)消耗ATP的過程,與此同時(shí),在大腸桿菌中過表達(dá)VHb可提高ATP的生產(chǎn)效率。由此推測(cè),改變?cè)谄蒸斕m糖合成過程中調(diào)控中間體合成的酶活性,也可間接調(diào)控普魯蘭糖的產(chǎn)量。如,改變其他調(diào)控脂質(zhì)、ATP合成等酶的活性,也可能會(huì)對(duì)普魯蘭糖的產(chǎn)量產(chǎn)生影響,為改造菌種提供了一個(gè)新思路。
此外,改變菌種的培養(yǎng)環(huán)境也可調(diào)節(jié)普魯蘭糖的產(chǎn)量。Sheng等[22]研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)時(shí)添加腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶雖然增加了生物量,但是并未促進(jìn)普魯蘭糖產(chǎn)生,而增加尿嘧啶可增加普魯蘭糖的積累量。尿嘧啶的添加時(shí)間很重要:在發(fā)酵時(shí)間0 h時(shí)添加,尿嘧啶僅作為為氮源刺激細(xì)胞生長,而普魯蘭糖的產(chǎn)量減少;但是在48 h添加,普魯蘭糖產(chǎn)量增加。本文研究人員推測(cè)可能因?yàn)槟蜞奏な荱DP-葡萄糖的前體,UDP-葡萄糖是普魯蘭糖合成的關(guān)鍵因素,添加的尿嘧啶可能提供了額外的葡萄糖基供體。
Pan等[23]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在pH為5.5時(shí)可得到最高普魯蘭糖產(chǎn)量和最高UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的活性,pH過高或過低會(huì)影響普魯蘭糖產(chǎn)量和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶活性。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加CuSO4,能增加關(guān)鍵生物合成酶的活性,使細(xì)胞內(nèi)ATP維持在較高水平,普魯蘭糖的分泌速率加快,所有這些均有助于提高普魯蘭糖產(chǎn)量。由此可見,在不清楚如何調(diào)控普魯蘭糖的合成途徑時(shí),也可通過改變其培養(yǎng)環(huán)境從而提高產(chǎn)量。
2.1.5 副產(chǎn)物對(duì)普魯蘭糖合成的影響 在普魯蘭糖的生產(chǎn)過程中,也會(huì)產(chǎn)生重油、黑色素等副產(chǎn)物。重油是普魯蘭糖所產(chǎn)脂類物質(zhì)的主要成分。有文獻(xiàn)研究表明,普魯蘭糖產(chǎn)量和重油產(chǎn)量呈正相關(guān),研究者推測(cè)可能因?yàn)橹赜蛥⑴c普魯蘭糖合成所需基本單元糖脂中間體 lipid-葡萄糖的生成[19]。但是Price等[25]發(fā)現(xiàn)過度強(qiáng)化的重油合成能力能夠抑制普魯蘭糖的生成,由此看來并非重油合成能力越強(qiáng)普魯蘭糖合成能力越強(qiáng)。而在普魯蘭糖的生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的黑色素,會(huì)給最后的產(chǎn)物帶來較深的顏色,導(dǎo)致額外的脫色過程,增加成本[26]。Zheng等[27]認(rèn)為普魯蘭糖與黑色素之間的關(guān)系是正相關(guān)的,但是Guo等[28]卻得出了相反的結(jié)果。因此,黑色素與普魯蘭糖之間的關(guān)系需研究者進(jìn)行更多、更深入的探究。探索副產(chǎn)物是否影響普魯蘭糖的產(chǎn)量,以及影響的具體機(jī)制,有助于進(jìn)一步了解普魯蘭糖的合成和調(diào)控。
普魯蘭糖的實(shí)際應(yīng)用除了受到合成產(chǎn)量的影響之外,還受到其分子量的制約,而其分子量也受到多種條件的影響。
普魯蘭酶是一種脫支酶,可特異性水解普魯蘭糖中的α-1,6糖苷鍵[29]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道基于底物特異性和終產(chǎn)物,可將其分為5類[30]:(i)I型普魯蘭酶特異性水解普魯蘭糖中的α-1,6糖苷鍵以產(chǎn)生麥芽三糖[31-32];(ii)II型普魯蘭酶(amylopullulanase)攻擊普魯蘭糖中的α-1,6糖苷鍵,產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的混合物;(iii)I型普魯蘭水解酶(neopullulanase)攻擊普魯蘭糖中的α-1,4鍵,產(chǎn)生潘糖[33];(iv)II型普魯蘭水解酶(isopullulanase)攻擊普魯蘭糖中的α-1,4連接以產(chǎn)生異葡糖基麥芽糖,產(chǎn)生異潘糖[34];(v)III型普魯蘭水解酶攻擊普魯蘭糖中的α-1,6以及α-1,4鍵,形成麥芽三糖、潘糖、麥芽糖和葡萄糖的混合物。
Liu等[35]研究確認(rèn)α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和普魯蘭酶在高分子量普魯蘭糖的生物合成中起著重要作用。刪除它們的單個(gè)基因后,產(chǎn)生的普魯蘭糖的分子量都能大大增加,但產(chǎn)量下降?;蚧匮a(bǔ)后,普魯蘭糖的產(chǎn)量恢復(fù),分子量回降。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,α-淀粉酶,葡糖淀粉酶和普魯蘭酶可調(diào)節(jié)普魯蘭糖的分子量。普魯蘭糖分子量的提高會(huì)使發(fā)酵液黏度變大,影響溶氧和傳質(zhì),導(dǎo)致產(chǎn)量下降。
據(jù)報(bào)道,在普魯蘭糖合成的過程中,過高的碳源會(huì)抑制普魯蘭糖合成。Wang等[36]刪除菌種中的CREA基因(編碼葡萄糖抑制因子)后,普魯蘭糖產(chǎn)量增加,分子量降低;進(jìn)行CREA基因回補(bǔ)后,普魯蘭糖產(chǎn)量減少。同時(shí),在刪除CREA基因菌種中檢測(cè)到編碼-淀粉酶,葡糖淀粉酶和普魯蘭酶的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。
普魯蘭糖分子量的大小除了受到多種酶的調(diào)節(jié)外,也受其他培養(yǎng)條件的影響。Sheng等[37]研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加Tween 80可顯著增加普魯蘭糖產(chǎn)量,且0.5 %Tween 80是最佳濃度;但添加后,獲得的普魯蘭糖的分子量與對(duì)照組相比明顯降低,原因可能是加入Tween 80改變了細(xì)胞膜的通透性,加快了細(xì)胞膜內(nèi)外的物質(zhì)交換。Wang等[38]在培養(yǎng)基中添加3 g/L的NaCl后,使普魯蘭糖濃度提高了26.7 %,但分子量降低到原來的46.8 %。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),NaCl增加了α-磷酸葡萄糖變位酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、α-淀粉酶的活性及轉(zhuǎn)錄水平,同時(shí)增強(qiáng)了ATP的供應(yīng),并將細(xì)胞內(nèi)UDP-葡萄糖維持在較高水平,原因可能是NaCl增加普魯蘭糖產(chǎn)量但降低了其分子量。
由此可見,在獲得較高普魯蘭糖產(chǎn)量時(shí),其分子量一般較低;當(dāng)獲得較高分子量的普魯蘭糖時(shí),其產(chǎn)量較低。如何在提高普魯蘭糖產(chǎn)量的同時(shí)調(diào)控其分子量的變化,制約著其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn),也為進(jìn)一步研究普魯蘭糖產(chǎn)業(yè)化研究指明了方向。
由于普魯蘭糖獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),在自然界可被微生物降解利用,不會(huì)引起環(huán)境污染,在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有越來越廣泛的應(yīng)用,進(jìn)一步推動(dòng)其工業(yè)化生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)和提高;而如何獲得高產(chǎn)菌種、減少副產(chǎn)物生成、降低生產(chǎn)成本則成為研究的關(guān)鍵。因此,闡明普魯蘭糖合成途徑的各個(gè)步驟及各種酶在其中的作用機(jī)制、優(yōu)化其培養(yǎng)條件、探索更多可進(jìn)行調(diào)控的酶及物質(zhì),是工業(yè)化高效生產(chǎn)的關(guān)鍵與基礎(chǔ),也有助于普魯蘭糖產(chǎn)品更快的推向市場(chǎng)。