孟玉生等

[摘要] 目的 研究涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織和涎腺炎癥中人β-防御素-2（HBD-2）mRNA和蛋白的表達(dá)特征。方法 對(duì)不同涎腺組織，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Real-Time PCR）和免疫組化檢測(cè)HBD-2的表達(dá)，并分析HBD-2 mRNA和蛋白在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中的表達(dá)差異。結(jié)果 與涎腺正常組織比較，良性腫瘤組HBD-2 mRNA表達(dá)量為其6.468倍，顯著高于涎腺正常組織組（P<0.05）；惡性腫瘤組為其0.334倍，顯著低于涎腺正常組織組（P<0.05）；涎腺炎癥組為其10.563倍，顯著高于涎腺正常組織組（P<0.05）。HBD-2不僅在這些組織的細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)，而且在惡性組織中的細(xì)胞核也有表達(dá)。結(jié)論 HBD-2在涎腺良性腫瘤組織及涎腺炎癥組織中高表達(dá)，在涎腺惡性腫瘤組織中低表達(dá)，其蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 人β-防御素-2； 涎腺腫瘤； 涎腺炎癥

[中圖分類號(hào)] Q 786 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.017

在我國(guó)涎腺腫瘤占人頭頸部腫瘤的2%～3%[1]，發(fā)病率比較高，常發(fā)生在主要的腺體中。β-防御素屬于抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），在天然免疫過程中表現(xiàn)多種作用，屬于固有免疫系統(tǒng)，對(duì)于抗原呈遞的樹突細(xì)胞具有誘導(dǎo)刺激作用[2]。最近人β-防御素-2（human beta-defensin-2，HBD-2）被認(rèn)為是位于染色體8p23上的備用腫瘤抑制基因，HBD-2基因在一系列細(xì)胞中的超表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡蛋白-3調(diào)控細(xì)胞凋亡或者是細(xì)胞的完全死亡通過特殊的細(xì)胞表面受體來調(diào)節(jié)[3]。HBD-2首先在牛皮癬患者的皮膚中被發(fā)現(xiàn)，還表達(dá)于包皮、肺、氣管、口腔黏膜等組織[4]，HBD-2通過上皮表面分泌的一種小的可溶縮氨酸發(fā)揮抗菌作用。HBD-2能被細(xì)菌、細(xì)菌毒性產(chǎn)物以及諸如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-

1β、IL-16、IL-8或者腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等細(xì)胞因子誘導(dǎo)，此外合成的HBD-

2能抑制膀胱癌細(xì)胞系TSU-Pr1的增殖，可導(dǎo)致腎癌細(xì)胞的凋亡[5]。在90%的腎癌細(xì)胞和82%的惡性前列腺癌中都發(fā)現(xiàn)有HBD-2的減少，而在良性的上皮瘤中有持續(xù)的高表達(dá)[6]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究HBD-2 mRNA和蛋白在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中的表達(dá)情況，及其在這些中的表達(dá)位置。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Trizol（Gibco公司，美國(guó)），PrimeScript RT MasterMix、PremixTaq Version2.0、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，Real-Time PCR）SYBR Premix Ex Taq（Takara公司，日本），免疫組織化學(xué)試劑盒（Invitrogeng公司，美國(guó)），SP免疫組化試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

實(shí)驗(yàn)引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。HBD-2的上游引物：5-CATGAGGGTCT-TGTATCTCCTCT-3，下游引物：5-CCTCCTCAT-GGCTTTTTGCAGC-3。β-actin的上游引物：5-AA-ACTGGAACGGTGAAGGTG-3， 下游引物：5-AG-TGGGGTGGCTTTTAGGAT-3。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 選取2008—2010年在北京大學(xué)深圳醫(yī)院經(jīng)手術(shù)和病理證實(shí)的涎腺良性腫瘤標(biāo)本32例，其中男19例，女13例，平均年齡45.7歲。正常涎腺標(biāo)本23例，其中男13例，女10例，平均年齡43.5歲。惡性腫瘤標(biāo)本10例，其中男6例，女4例，平均年齡57.6歲。炎癥標(biāo)本16例，其中男10例，女6例，平均年齡52.9歲。所選標(biāo)本一份保存于液氮中，用于提取RNA；一份以4%多聚甲醛固定，4 ℃存放，用于免疫組化檢測(cè)。以上標(biāo)本的獲得均取得患者知情同意。

1.2.2 HBD-2在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中的表達(dá) 用Trizol法從各個(gè)標(biāo)本中提取mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；將cDNA用于PremixTaq Ver-sion2.0試劑做PCR分析表達(dá)情況。并將cDNA用于Real-Time PCR，定量檢測(cè)HBD-2 mRNA表達(dá)，具體的步驟參照試劑盒說明。Real-Time PCR條件：

95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。對(duì)HBD-2以及內(nèi)參照β-actin分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，PCR定量計(jì)算mRNA，待測(cè)樣品中的表達(dá)量用2-△Ct表示，2-△Ct = 2-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。

1.2.3 免疫組化 所有的切片均經(jīng)光學(xué)顯微鏡下盲法評(píng)分。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野（×400）進(jìn)行判斷，以腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性計(jì)分，2個(gè)分值相加即為該標(biāo)本的免疫組化陽(yáng)性計(jì)分，具體如下。1）陰性表達(dá)或無表達(dá)：0～1分；2）弱陽(yáng)性：2～3分；3）陽(yáng)性：4～5分；4）強(qiáng)陽(yáng)性：6～7分。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無色；1分為細(xì)胞染色呈淺黃色；2分為細(xì)胞呈黃色；3分為細(xì)胞呈棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞比例：1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；76%～100%為4分。規(guī)定積分≥3分為陽(yáng)性，無陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為0。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)Real-Time PCR結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)分析，采用Fishers exact test計(jì)算免疫組化評(píng)分結(jié)果，并采用Continuity correction對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 HBD-2的分子檢測(cè)

PCR結(jié)果顯示，在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中均可檢測(cè)到HBD-2 mRNA（圖1）。

1：Marker；2：良性腫瘤組織；3：惡性腫瘤組織；4：炎癥組織；5：正常涎腺組織。

圖 1 涎腺腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中均見HBD-2

的表達(dá)

Fig 1 The expression of HBD-2 in tumor tissue， inflammation tis-

sue and normal salary gland tissue

Real-Time PCR結(jié)果顯示，與正常涎腺組織組比較，良性腫瘤組HBD-2 mRNA表達(dá)量為其6.468倍，顯著高于正常涎腺組織組（P<0.05）；惡性腫瘤組為其0.334倍，顯著低于正常涎腺組織組（P<0.05）；炎癥組織組為其10.563倍，顯著高于正常涎腺組織組（P<0.05）（圖2）。

圖 2 HBD-2 mRNA在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎

癥組織和正常涎腺組織中的表達(dá)

Fig 2 The expression of HBD-2 mRNA in salary gland benign tu-

mor， cancer and inflammation tissue and normal salary

gland tissue

2.2 HBD-2在不同涎腺組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，HBD-2蛋白表達(dá)于表皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，正常涎腺組織、涎腺良性腫瘤組織和炎癥組織中皆可檢測(cè)到HBD-2表達(dá)，但在涎腺惡性腫瘤中陰性表達(dá)常見。與正常涎腺組織比較，惡性腫瘤組織HBD-2表達(dá)顯著降低；炎癥組織和良性腫瘤組織HBD-2表達(dá)顯著增強(qiáng)，表達(dá)見于細(xì)胞漿區(qū)（圖3）。將HBD-2陰性表達(dá)和弱陽(yáng)性表達(dá)限定為低表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，HBD-2在涎腺惡性腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于正常組織（P<0.05），并且其表達(dá)不僅局限于細(xì)胞漿中，在細(xì)胞核中也有發(fā)現(xiàn)。HBD-2蛋白在涎腺正常組織、炎癥組織、良性腫瘤和惡性腫瘤組織中的表達(dá)情況見表1。

3 討論

存在于人體的防御素分為兩類，分別為α-防御素和β-防御素，HBD-2是β-防御素中的一種[7]。防御素在天然免疫功能中表現(xiàn)多種作用，一些報(bào)道暗示人類的HBD具有潛在腫瘤抑制作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常組織，炎癥組織HBD-2 mRNA的表達(dá)量為其10.563倍，良性腺瘤中HBD-2 mRNA的表達(dá)量為其6.468倍，而在惡性腫瘤中其表達(dá)有所下降。免疫組化顯示，相對(duì)于正常組織，炎癥組織、良性腫瘤中HBD-2的表達(dá)水平有所上升，惡性腫瘤HBD-2表達(dá)有所下降；不僅表達(dá)量有變化，表達(dá)位置也有改變，正常組織、炎癥組織和良性腫瘤中HBD-2僅出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，而惡性腫瘤中其在細(xì)胞質(zhì)和胞核中都有表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明HBD-2可能與涎腺炎癥或發(fā)生腫瘤時(shí)微生物感染、炎癥因子的持續(xù)刺激、機(jī)體為了抵抗微生物入侵[9]、上調(diào)HBD-2表達(dá)有關(guān)。有研究[10]表明， HBD-2的表達(dá)可能由炎癥刺激因素誘導(dǎo)產(chǎn)生；其次在惡性涎腺腫瘤中除了基因改變外，它也有可能是一種抑制劑，這些都可能在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮潛在作用。HBD-2作為機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的組成部分，與某些炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)展有密切的關(guān)系。研究[11]發(fā)現(xiàn)防御素能夠裂解腫瘤細(xì)胞，其裂解作用與防御素濃度密切相關(guān)，溫度下降或有血清存在時(shí)被抑制；發(fā)現(xiàn)鼠惡性畸胎瘤細(xì)胞在體外經(jīng)人中性粒細(xì)胞多肽作用后，回移體內(nèi)喪失致瘤性[12]。目前已在多種組織的腫瘤中檢測(cè)出防御素的表達(dá)[13]。

在研究防御素與口腔疾病的關(guān)系時(shí)，防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用，與多種口腔黏膜疾?。谇粷?、扁平苔蘚、白斑及口腔白色假絲酵母菌等）關(guān)系密切[14]，口腔內(nèi)齲齒的發(fā)生也與β-防御素的表達(dá)有關(guān)[15]。

在口腔腫瘤學(xué)方面，Abiko等[16]報(bào)道在涎腺角化腫瘤中的HBD縮氨酸意味著腺管細(xì)胞在炎癥和癌癥的角化作用情況下發(fā)生了鱗狀上皮化生。此外Sawaki等[17]曾經(jīng)報(bào)道口腔鱗狀細(xì)胞癌有HBD-2存在并且其濃度水平高，部分HBD-2濃度高的患者術(shù)后預(yù)后較好，有些濃度低的患者可發(fā)生3年內(nèi)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。Wenghoefer等[18]發(fā)現(xiàn)很多口腔病變中HBD-2減少，但在口腔鱗狀上皮癌中有所增加，認(rèn)為HBD-2在調(diào)控口腔鱗癌凋亡的轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)中扮演著重要角色。

筆者目前的研究表明：在惡性涎腺腫瘤與正常組織、涎腺炎癥組織和良性腫瘤的比較中，HBD-2基因和蛋白表達(dá)下降，HBD-2蛋白發(fā)生從胞質(zhì)到胞核的表達(dá)改變。雖然到目前為止這種蛋白核轉(zhuǎn)移的原因和生物學(xué)影響都還未知，但是HBD-2在細(xì)胞核中的聚集似乎導(dǎo)致了基因表達(dá)下降，這些都可能在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮潛在的作用。

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（本文編輯 杜冰）