李武珊，陳麗君

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟(jì)南 250012)

納米材料和納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用是目前研究的熱點(diǎn)，金納米粒子(納米金，gold nanoparticles，AuNP)通常指直徑為1～100 nm 的金顆粒，AuNP在水中因?yàn)殪o電作用可形成穩(wěn)定存在的膠體狀態(tài)，因此也稱(chēng)膠體金(gold colloids)。AuNP具有表面積大，易被活性基團(tuán)修飾和吸收紅外線(xiàn)而發(fā)熱等物理和化學(xué)特點(diǎn)，金納米粒子不僅在電子、催化等科技領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，而且被越來(lái)越多地應(yīng)用于生物檢測(cè)、醫(yī)學(xué)成像、藥物和基因運(yùn)輸以及腫瘤治療等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[1－5]。如抗原抗體反應(yīng)中以AuNP作為標(biāo)記物，可應(yīng)用于免疫學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的診斷和檢測(cè)[1，6];在腫瘤診斷和治療方面，靶向標(biāo)記的AuNP可用于細(xì)胞成像，明顯提高腫瘤檢測(cè)的靈敏度[7－8];AuNP可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[9－10];AuNP吸收紅外線(xiàn)而產(chǎn)熱的特點(diǎn)被用于腫瘤的光熱療法，采用紅外照AuNP可升高特定部位細(xì)胞的溫度而發(fā)揮殺腫瘤細(xì)胞作用[11];AuNP可以裝載抗腫瘤藥物，紅外線(xiàn)照射可控制釋放藥物[12－14];表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗體、葡萄糖和葉酸修飾的AuNP可靶向結(jié)合于腫瘤細(xì)胞，為腫瘤的靶向治療提供新的思路和方法[9，15－16]。

隨著AuNP在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，需要系統(tǒng)地評(píng)價(jià)AuNP的生物安全性，因此，眾多研究者致力于研究AuNP對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物的毒性，但是目前研究結(jié)果不一致，通常認(rèn)為AuNP的毒性與其顆粒大小、形狀、表面修飾物以及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞類(lèi)別有關(guān)[1，17－18]。如體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，AuNP 對(duì)白血病細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞沒(méi)有體現(xiàn)出毒性[19－20]，而在人肺成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AuNP可引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激和自我吞噬反應(yīng)[21]，1.4 nm的AuNP可引起宮頸癌細(xì)胞壞死，而15 nm的AuNP對(duì)宮頸癌細(xì)胞幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性[22]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，一般認(rèn)為AuNP的生物兼容性比較好，靜脈注射的AuNP可以被有效地排出體外[1]，但是也有研究發(fā)現(xiàn)AuNP可引起肝急性炎癥[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)，采用灌胃給予AuNP比靜脈注射引起的毒性大，可明顯引起動(dòng)物體質(zhì)量減輕等不良反應(yīng)[24]。文獻(xiàn)對(duì)金納米粒子的生物毒性研究，多停留在表面現(xiàn)象的觀察上，對(duì)于其作用機(jī)制知之甚少，AuNP進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞中何種物質(zhì)做出主要反應(yīng)，尚缺乏有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中表達(dá)的一種三肽類(lèi)化合物，在肝中表達(dá)最為豐富，GSH在細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)功能之一是解毒，如清除活性氧和解毒重金屬化合物，從而保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境中一些致病因子的損傷[25－27]。AuNP由金原子組成，GSH是否對(duì)AuNP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用值得探討。

本研究采用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO-K1研究直徑為13 nm的AuNP的毒性作用和GSH對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO-K1，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。F12K培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，丁硫氨酸-亞砜亞胺(L-buthionine-sulfoximine，BSO)、還原型 GSH，TRITC-鬼筆環(huán)肽(TRITC-phalloidin)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，JC-1線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、GSH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，直徑13 nm的AuNP由山東大學(xué)化學(xué)院丁軼課題組提供。倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，激光掃描共聚焦顯微鏡為德國(guó)Zeiss公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

含 10%胎牛血清、谷氨酰胺 2 mmol·L－1、青霉素100 kU·L－1、鏈霉素 100 mg·L－1的 F12K 培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37℃培養(yǎng)箱，飽和濕度，5%CO2，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代細(xì)胞。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率[28]

細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，棄去原培養(yǎng)液，加入含有 AuNP 10，20，50 和 100 μmol·L－1的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，加入MTT母液，使MTT濃度為0.5 g·L－1，37℃中孵育 3～4 h，棄去原培養(yǎng)基，加入200 μl DMSO，混勻，酶標(biāo)儀下檢測(cè)570 nm處的吸光度(A570nm)，以對(duì)照組為參考，計(jì)算各組存活率。存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

1.4 倒置顯微鏡下觀察CHO-K1細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，棄去原培養(yǎng)液，按照分組，分別加入含有 AuNP 10 μmol·L－1，BSO 20 μmol·L－1和 AuNP+BSO+GSH 1 mmol·L－1的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，將細(xì)胞培養(yǎng)板放到倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 TRITC-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞微絲[29]

將細(xì)胞接種于無(wú)菌蓋玻片上(在培養(yǎng)皿中)，培養(yǎng)過(guò)夜，加入分別含 AuNP 10 μmol·L－1，BSO 20 μmo·lL－1，AuNP+BSO和AuNP+BSO+GSH 1 mmol·L－1的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48 h，PBS 洗 2 次，4%多聚甲醛固定，PBS洗2次，0.1%Triton X-100孵育5 min，用含有1%BSA的PBS緩沖液洗滌2次，室溫下孵育60 min封閉非特異吸附，加入TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽室溫染色30 min，含1%BSA的PBS緩沖液洗滌3次，共聚焦顯微鏡觀察，與空白對(duì)照組進(jìn)行比較。

1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率[28]

接種細(xì)胞于六孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，棄去原培養(yǎng)液，加入分別含有AuNP，BSO，AuNP+BSO和AuNP+BSO+GSH的培養(yǎng)基，72 h后經(jīng)胰酶-EDTA消化，取細(xì)胞PBS洗2次，然后使用AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒進(jìn)行染色，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，染色結(jié)束后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinⅤ-FITC和PI陽(yáng)性的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡的百分比，各組進(jìn)行比較。

1.7 JC-1標(biāo)記流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位[29]

接種細(xì)胞于 6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，加入含有AuNP，BSO，AuNP+BSO 和 AuNP+BSO+GSH的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，JC-1染色，37℃20 min，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀分析紅光和綠光強(qiáng)度，膜電位正常時(shí)，產(chǎn)生紅色熒光，膜電位破壞時(shí)，產(chǎn)生綠色熒光，綠光強(qiáng)度與紅光強(qiáng)度的比值可以反映線(xiàn)粒體膜電位的破壞情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 金納米粒子對(duì)CHO-K1細(xì)胞存活的影響

表1 結(jié)果所示，AuNP 10，20，50 和100 μmol·L－1對(duì)卵巢細(xì)胞CHO-K1存活率無(wú)明顯影響。

Tab.1 Effect of gold nanoparticles(AuNP)on CHO-K1 cell survival rate

2.2 AuNP對(duì)低GSH水平CHO-K1細(xì)胞存活的影響

表2結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比，單獨(dú)AuNP 10 μmo·lL－1或BSO 20 μmo·lL－1對(duì)CHO-K1細(xì)胞存活無(wú)明顯影響，兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，能夠明顯抑制CHO-K1細(xì)胞存活，抑制率(82±2)%(P＜0.01)，說(shuō)明細(xì)胞GSH水平被BSO抑制后，AuNP會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用;若同時(shí)再加入外源性的 GSH 1 mmo·lL－1，細(xì)胞存活恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。

Tab.2 Effect of AuNP on cell surival of CHO-K1 with low GSH level

2.3 AuNP對(duì)低GSH水平CHO-K1細(xì)胞形態(tài)影響

圖1結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比(圖1A)，單獨(dú)AuNP 10 μmol·L－1(圖1B)或 BSO 20 μmol·L－1(圖1C)對(duì)CHO-K1細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響，兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體皺縮，變圓(圖1D);若同時(shí)再加入外源性的 GSH 1 mmol·L－1，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)至正常對(duì)照組水平(圖1E)。

2.4 AuNP對(duì)低GSH水平CHO-K1細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的影響

圖2結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比(圖2A)，單獨(dú)AuNP 10 μmol·L－1(圖2B)或 BSO 20 μmol·L－1(圖2C)對(duì)CHO-K1細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)被明顯破壞(圖2D);若同時(shí)再加入外源性的GSH 1 mmol·L－1，細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)恢復(fù)至正常對(duì)照組水平(圖2E)。

2.5 AuNP對(duì)低GSH水平CHO-K1細(xì)胞凋亡的影響

圖3結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比(圖3A)，單獨(dú)AuNP 10 μmol·L－1(圖3B)或 BSO 20 μmol·L－1(圖3C)不能誘導(dǎo)CHO-K1細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率明顯增加，凋亡率為(65.7±5.8)%(圖3D，n=3，P＜0.01);若同時(shí)再加入外源性的GSH 1 mmol·L－1，細(xì)胞凋亡率恢復(fù)至正常對(duì)照組水平，凋亡率為(4.3±0.7)%(圖3E)。正常對(duì)照組凋亡率為(3.11±0.31)%，AuNP和BSO單獨(dú)處理的細(xì)胞凋亡率分別為(3.4±0.5)%和(4.1±0.6)%，與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異。

Fig.1 Effect of AuNP on morphology of CHO-K1 cells with low GSH level.The cells were treated with drugs for 72 h.A:normal control;B:AuNP 10 μmol·L－1group;C:BSO 20 μmol·L－1group;D:AuNP 10 μmol·L－1+BSO 20 μmol·L－1group;E:AuNP 10 μmol·L －1+BSO 20 μmol·L －1+GSH 1 mmol·L －1group.

Fig.2 Effect of AuNP on microfilament of CHO-K1 cells with low GSH level.A:normal control;B:AuNP 10 μmol·L －1;C:BSO 20 μmol·L－1;D:AuNP 10 μmol·L－1+BSO 20 μmol·L－1;E:AuNP 10 μmol·L－1+BSO 20 μmol·L－1+GSH 1 mmol·L－1.The representative fields were photographed at 630×(oil)magnification by confocal laser scanning microscopy.

Fig.3 Effect of AuNP on apoptosis of CHO-K1 cells with low GSH level.A:normal control;B:AuNP 10 μmol·L －1;C:BSO 20 μmol·L －1;D:AuNP 10 μmol·L －1+BSO 20 μmol·L －1;E:AuNP 10 μmol·L －1+BSO 20 μmol·L －1+GSH 1 mmol·L －1 .

2.6 AuNP對(duì)低GSH水平CHO-K1細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響

表3結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比，單獨(dú)AuNP 10 μmol·L－1或BSO 20 μmol·L－1對(duì)CHO-K1細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位無(wú)明顯影響，兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位發(fā)生明顯破壞(綠光/紅光比值明顯增大);若同時(shí)再加入外源性的 GSH 1 mmol·L－1，細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。

Tab.3 Effect of AuNP on mitochondrial membrane potential of CHO-K1 cells with low GSH level

3 討論

本研究結(jié)果顯示，AuNP 濃度達(dá)到100 μmol·L－1對(duì)正常的卵巢細(xì)胞CHO-K1無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，與文獻(xiàn)報(bào)道的良好生物兼容性一致[1，19－20]。但 AuNP的化學(xué)成分是重金屬金，毒性體現(xiàn)不出來(lái)有兩種可能，一是對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，另外一種可能是細(xì)胞中的相應(yīng)物質(zhì)可以解除AuNP的毒性。文獻(xiàn)報(bào)道GSH可能是解除AuNP毒性的關(guān)鍵物質(zhì)[25－27]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)CHO-K1細(xì)胞GSH含量被BSO抑制后，AuNP使細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，微絲結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細(xì)胞發(fā)生凋亡;補(bǔ)充外源性的GSH后，細(xì)胞存活率和細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)，細(xì)胞無(wú)明顯凋亡，與正常對(duì)照組細(xì)胞無(wú)顯著差異，結(jié)果提示GSH是細(xì)胞應(yīng)對(duì)AuNP毒性的重要物質(zhì)。

AuNP的化學(xué)組成為金，鉑類(lèi)化合物可以損傷線(xiàn)粒體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]，金與鉑同為重金屬化合物，有可能會(huì)對(duì)線(xiàn)粒體產(chǎn)生一定的損傷，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AuNP可能通過(guò)線(xiàn)粒體損傷誘導(dǎo)低表達(dá)GSH的細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果提示，AuNP的生物相容性是有條件的，即細(xì)胞需要有足夠的GSH來(lái)對(duì)抗AuNP的毒性，如果因?yàn)樗幬锖筒±碓驅(qū)е录?xì)胞和機(jī)體缺乏GSH，會(huì)出現(xiàn)AuNP的毒性。因此，要謹(jǐn)慎對(duì)待AuNP的生物醫(yī)學(xué)特性。

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