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      綿羊角蛋白中間絲基因KIF1.2的克隆及序列分析

      2013-11-12 07:04:36姜仁軍李樹偉
      關(guān)鍵詞:角蛋白羊毛毛囊

      劉 鑫 姜仁軍 王 成 李樹偉,*

      (1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)(2 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾843300)

      羊毛是羊皮膚的衍生物,羊毛的品質(zhì)主要決定于羊毛皮質(zhì)內(nèi)的毛纖維。羊毛纖維具有高度的組織結(jié)構(gòu),角蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白是其構(gòu)成的主要組成成分。角蛋白相關(guān)蛋白基因(keratin associated proteins,KAP)是編碼毛發(fā)纖維組成蛋白的一種結(jié)構(gòu)基因,由多基因家族編碼[1]。它與羊毛纖維的品質(zhì)密切相關(guān)。同時(shí)也與遺傳,營養(yǎng)、生理及環(huán)境等因素有關(guān)。不同地區(qū)、不同品種絨山羊所產(chǎn)生的羊絨有明顯的品質(zhì)差異[2]。羊毛纖維的90%是由角蛋白中間絲(Keratin intermediate filament,KRT-IF)和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Keratin associated proteins,KAPs)所構(gòu)成。要提高羊毛品質(zhì)的關(guān)鍵問題是要調(diào)控決定羊毛品質(zhì)的基因,特別是毛囊角蛋白基因是如何發(fā)生基因表達(dá)來參與羊毛性狀的調(diào)控等這些復(fù)雜因素和相關(guān)基因位點(diǎn)及相互之間的關(guān)系還不很清楚。當(dāng)前,科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)主要是針對(duì)構(gòu)成羊毛纖維的角蛋白中間絲(Keratin intermediate filament,KRT-IF)和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Keratin associated proteins,KAPs)的相關(guān)基因的研究上[3]。

      目前,大部分研究都集中在對(duì)毛囊KAPs 基因家族多態(tài)性的課題研究上,對(duì)一個(gè)品種的單個(gè)基因的深入研究并不多。因此,本研究以南疆地方品種羊和田羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物,以KIF1.2 角蛋白中間絲基因?yàn)檠芯繉?duì)象,成功克隆KIF1.2 基因,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,旨在為深入探討綿羊毛囊KIF1.2 基因的表達(dá)對(duì)綿羊性狀的影響提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

      本課題組在動(dòng)物試驗(yàn)站飼養(yǎng)的和田羊平原型和山區(qū)型,樣品的總RNA的由本課題組提供,儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。

      1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

      智能型熱循環(huán)儀PCR 儀(IcyclerTM Thermal Cycler)、移液器(Eppendorf)等。臺(tái)式小型高速離心機(jī)(MIKR0120),電泳儀(Bio- RAD),凝膠分析系統(tǒng)(GELDOC2000),低溫高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA),蛋白電泳儀(北京六一儀器廠),高壓滅菌鍋(HVE50)。

      1.3 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

      ExTaq 酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Nde I、RNase Inhibitor、dNTP、DNA Maker(DL2000 和DL15000)均購自TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司。UNIQ-10 柱式DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生物有限公司。氯仿、TEMED、異戊醇、異丙醇、MgCl2、NaCl、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

      1.4 菌株與質(zhì)粒

      大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、克隆載體pMD18-T 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

      1.5 角蛋白中間絲基因KIF1.2的PCR 擴(kuò)增

      1.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

      和田羊毛囊角蛋白中間絲KIF1.2 基因PCR 引物的設(shè)計(jì)與合成參照GenBank 中公布的普通綿羊基因序列KIF1.2(M23912.1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,上游引物(P1):5’-CATATGTCTTTCAACTTCTGCC-3’,下游引物(P2):5’-GAATTCCTGGTGCACAAAGGTGTTGC-3’。預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為1215 bp。引物由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

      1.5.2 KIF1.2 基因的PCR 擴(kuò)增

      以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 第一鏈為模板,PCR 擴(kuò)增KIF1.2 基因。反應(yīng)體系25 μl,其中,模板DNA 1 μl,上下游引物各為0.5 μl(10 μΜ),Ex Taq 酶0.2 μl(5 U/μl),dNTP 0.5 μl,10 × TaqBuffer 2.5 μl,ddH2O 18.9 μl。反應(yīng)條件為94℃10 min;94℃45 s,退火溫度45 s,72℃1 min,35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min 。擴(kuò)增片段大小為1215 bp。目的基因的回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定均按常規(guī)方法操作[4]。取5 μl的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,將擴(kuò)增的單一目的條帶進(jìn)行回收。所有PCR 純化回收后的產(chǎn)物于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

      表1 KIF1.2 基因PCR 擴(kuò)增體系

      1.5.3 PCR 產(chǎn)物和載體的連接與鑒定

      將回收的角蛋白中間絲KIF1.2 目的基因PCR產(chǎn)物定向連接到pMD18-T 載體上,熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,將經(jīng)過PCR 鑒定的陽性質(zhì)粒DNA 用Nde I 和EcoR I 雙酶切鑒定,將上述鑒定所得到的陽性重組子送至生工生物工程(上海)有限公司測定序列。

      1.5.4 序列分析

      序列同源性分析采用DNAMAN 軟件完成。

      2 結(jié)果

      2.1 目的片段的擴(kuò)增結(jié)果分析

      對(duì)提取的和田羊山區(qū)型和平原型皮膚毛囊總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,通過PCR 擴(kuò)增,進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。(圖1)可見在1215 bp 處有明亮的特異性條帶,陰性對(duì)照無條帶,結(jié)果顯示片段的大小和預(yù)期的結(jié)果一致,初步表明正確的擴(kuò)增基因的目的片段。

      圖1 KIF1.2 基因目的片段PCR 擴(kuò)增

      2.2 重組質(zhì)粒的PCR 檢測及酶切鑒定

      將初步鑒定出來的質(zhì)粒DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并用NdeI 和EcoR I 雙酶切檢測(山區(qū)型),均獲得了大小為1215 bp的單一明亮條帶(圖2,圖3)

      2.3 測序結(jié)果

      圖2 KIF1.2 基因重組質(zhì)粒PCR 電泳

      通過DNAMAN 軟件將質(zhì)粒測序的結(jié)果與Gen-Bank KIF1.2(M23912.1)進(jìn)行對(duì)比分析表明,該序列全長1215 bp 大小,其中共有三處堿基突變,分別是915 bp 處T 突變?yōu)镃,1136 bp 處G 突變?yōu)锳,1139 bp 處A 突變?yōu)镚,同源性為99%,說明該序列呈現(xiàn)高度的保守性,KIF1.2 基因克隆成功。

      圖3 KIF1.2 基因重組質(zhì)粒酶切鑒定(山區(qū)型)

      圖4 KIF1.2 基因序列比對(duì)圖

      3 討論

      綿羊羊毛是畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的主要支柱,新疆作為我國重要的綿羊生產(chǎn)基地之一,細(xì)羊毛產(chǎn)業(yè)在國內(nèi)處于領(lǐng)先地位,南疆地方品種羊和田羊其毛被兩型毛多,長而均勻,毛的彈性、光澤和潔白度較好,是紡織工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料。但和田羊也存在體格較小,產(chǎn)毛量、產(chǎn)肉率和繁殖率不高等缺點(diǎn)。近些年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,綿羊羊毛的性狀研究已經(jīng)進(jìn)入了分子遺傳水平階段,也一直是國內(nèi)外很多專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

      對(duì)于角蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白的研究,科學(xué)家們對(duì)人,小鼠,綿羊的毛囊角蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白研究得比較多,山羊的毛發(fā)角蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白基因也有相關(guān)的報(bào)道[5,6]。到目前為止,科學(xué)家們估計(jì)角蛋白的數(shù)量大約在100 個(gè),因?yàn)榻堑鞍准捌浼易宄蓡T的大小和電荷都很相似,目前單一的電泳技術(shù)很難將所有的蛋白都分離出來。角蛋白中間絲蛋白KIF 包括兩個(gè)家族,即酸性(I 型)和堿性(Ⅱ型)角蛋白,脊椎動(dòng)物的KIF 由50 多個(gè)基因編碼,在毛囊發(fā)育過程中,I 型和Ⅱ型共聚構(gòu)成約10 nm的微絲纖維,充滿基質(zhì)角蛋白形成微絲束[7]。據(jù)報(bào)道,角蛋白中間絲I 型Ⅱ型基因家族在基因組中并不是緊密連鎖,I 型Ⅱ型基因是成簇分布的,并且角蛋白Ⅱ型可能含有保守的不同于上皮細(xì)胞的C 端結(jié)構(gòu)域[8]。

      利用綿羊毛囊毛角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因,通過基因技術(shù)改變羊毛纖維的蛋白組成,可以產(chǎn)生更加優(yōu)良的纖維類型。編碼羊毛I(xiàn) 型中間絲角蛋白KIF1.2 基因包括兩端500 bp的DNA 側(cè)翼,測序表明其原始轉(zhuǎn)錄本長度為5180 bp,具有7 個(gè)外顯子[9]。高水平皮質(zhì)特異性表達(dá)羊毛I(xiàn)I 型角蛋白中間絲基因KIF,能夠顯著改善羊毛纖維的微觀結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)基因羊毛纖維表現(xiàn)色澤亮而且彎曲度降低。同時(shí),過度表達(dá)K2.10的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物構(gòu)成大多數(shù)的II型中間絲蛋白不能和許很多表達(dá)的內(nèi)源性角蛋白I型中間絲構(gòu)成異二聚體[10]。與非轉(zhuǎn)基因的羊毛纖維相比較,轉(zhuǎn)基因羊的纖維皮層細(xì)胞中很難找到中間絲微纖維。最終對(duì)纖維結(jié)構(gòu)的影響效果是,擾亂了纖維皮質(zhì)中正皮質(zhì)與副皮質(zhì)細(xì)胞的組成,能造成纖維彎曲度降低的因素之一。

      本實(shí)驗(yàn)根據(jù)參照GenBank 中公布的普通綿羊基因序列設(shè)計(jì)合成了和田羊毛囊中間絲角蛋白KIF1.2 基因引物,以南疆地方品種和田羊毛為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用PCR 法成功獲得了中間絲角蛋白KIF1.2基因的成熟編碼序列。經(jīng)生物信息學(xué)分析,序列全長大小為1215 bp,有三處堿基發(fā)生突變,分別是915 bp 處T 突變?yōu)镃,1136 bp 處G 突變?yōu)锳,1139 bp 處A 突變?yōu)镚,同源性為99%。表明該序列呈現(xiàn)高度的保守性。中間絲角蛋白KIF1.2 基因的克隆為進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)載體以及制備其多克隆抗體提供了基礎(chǔ)依據(jù),從而為深入研究南疆地方品種綿羊角蛋白家族基因的定位,以及對(duì)羊毛性狀的調(diào)控機(jī)制等方面提供理論指導(dǎo)。

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