灰葡萄孢菌AUR1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及酶活性分析

邱永春，劉小平，茍萍

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046

鞘脂是真核細(xì)胞膜的主要組成成分，是構(gòu)成脂質(zhì)雙分子層的重要亞結(jié)構(gòu)，它在調(diào)節(jié)脂質(zhì)雙分子層膜的流動(dòng)性中起十分重要的作用。在過去二十年對(duì)鞘脂的研究中，發(fā)現(xiàn)鞘脂及其代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老和細(xì)胞的粘附和識(shí)別、膜運(yùn)輸和脂筏的形成等許多重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程有重要作用，進(jìn)而使細(xì)胞產(chǎn)生各種不同的生物學(xué)功能[1-5]。

近年相繼在酵母等真菌、原生動(dòng)物和擬南芥中發(fā)現(xiàn)肌糖磷脂酰神經(jīng)酰胺 (IPC)合成酶，該酶是鞘脂合成代謝的關(guān)鍵酶[6]。酵母的IPC合成酶由AUR1基因編碼，從人類病原真菌白假絲酵母Candida albicans、光滑假絲酵母 Candida glabrata、克柔假絲酵母Candida krusei、近平滑假絲酵母 Candida parapsilosis、熱帶假絲酵母Candidatropicalis和新型隱球菌，一些曲霉屬絲狀真菌煙曲霉 Aspergillus fumigatus、構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans、黑曲霉Aspergillus niger和米曲霉 Aspergillus oryzae，以及粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中分離得到AUR1類似基因，這些基因的序列很保守，具有IPC1p活性所需的共同結(jié)構(gòu)域，說明該基因的進(jìn)化是保守的[7-9]。AUR1表達(dá)和調(diào)控對(duì)真菌生長(zhǎng)和發(fā)育具有關(guān)鍵的作用，缺乏 IPC合成酶的酵母因不能合成復(fù)雜鞘脂類而死亡，而且導(dǎo)致神經(jīng)酰胺的積累[10]。神經(jīng)酰胺積累抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并通過阻止細(xì)胞周期引起細(xì)胞凋亡[11-12]，這都表明IPC合成酶是真菌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活所必需的。短梗霉素A (Aureobasidin A，AbA)是IPC合成酶的強(qiáng)烈抑制劑，真菌用AbA處理或真菌IPC合成酶基因表達(dá)抑制均導(dǎo)致細(xì)胞多重形態(tài)學(xué)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)生理生化特性的改變，包括微管消失，微管蛋白降解，細(xì)胞出芽方式的改變，細(xì)胞循環(huán)的阻滯，幾丁質(zhì)的異常積累，細(xì)胞膜完整性的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的滲漏，最終細(xì)胞死亡[7,13-14]。本研究通過構(gòu)建灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶基因 (BcAUR1)的重組穿梭質(zhì)粒 pYES2-BcAUR1，轉(zhuǎn)化釀酒酵母脲嘧啶突變菌株Δyor1，為研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶的表達(dá)及其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

灰葡萄孢菌由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院李紅葉教授實(shí)驗(yàn)室提供，大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae尿嘧啶突變菌株 Δyor1及pYES2穿梭載體購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

氨芐青素 (Amp) 購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，RT-PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ購(gòu)于 TaKaRa公司，ECL化發(fā)光試學(xué)劑盒(RPN2132)購(gòu)于 Amersham Biosciences公司，AbA、Tris、CHAPS、C6-NBD-Cer (6-[N-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-hexanoyl ceramide，帶熒光標(biāo)記的底物)、PI (磷脂酰肌醇)、甲酸 (CH3COOH)和膠回收試劑盒均購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，F(xiàn)LAG標(biāo)簽一抗、二抗為碧云天公司產(chǎn)品。

營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基 SC-U：無氨基酸酵母氮源(含硫酸銨)6.7 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，營(yíng)養(yǎng)缺陷混合物2 g，加水至1 000 mL，0.1 MPa，121 ℃，濕熱滅菌20 min。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：無氨基酸酵母氮源6.7 g，半乳糖20 g，瓊脂粉20 g，營(yíng)養(yǎng)缺陷混合物2 g，加水至1 000 mL，0.1 MPa，121 ℃，濕熱滅菌20 min。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)灰葡萄孢菌AUR1的cDNA序列設(shè)計(jì)合成含有 FLAG標(biāo)簽的引物，并在 F端加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，在R端加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物由華大基因合成 (表1)。

表1 文中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 RT-PCR

按試劑盒提取灰葡萄孢菌總 RNA (RNA提取試劑盒，鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，經(jīng)紫外分光光度法和凝膠電泳鑒定純度及濃度后，置-80 ℃?zhèn)溆?。? μL純化mRNA為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaKaRa公司的 RT-PCR試劑盒)說明書的方法合成 cDNA。利用以上引物和高保真DNA聚合酶對(duì)灰葡萄孢菌AUR1的cDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s，64 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物 (AUR1基因)用膠回收試劑盒進(jìn)行純化、回收，目的條帶連接到pMD18-T載體上，進(jìn)行測(cè)序。

1.5 重組穿梭質(zhì)粒pYES2-BcAUR1的構(gòu)建

BcAUR1和pYES2載體分別在37 ℃條件下用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切4 h，回收目的片段。BcAUR1和pYES2用T4 DNA連接酶在16 ℃連接過夜，載體構(gòu)建流程見圖 1。pYES2-BcAUR1轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑取單菌落 (單克隆)擴(kuò)繁，用堿裂解法提取質(zhì)粒，并通過 PCR的方法驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆菌株的pYES2-BcAUR1質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)驗(yàn)證BcAUR1沒有突變。

1.6 醋酸鋰轉(zhuǎn)化酵母及誘導(dǎo)表達(dá)

構(gòu)建好的pYES2-BcAUR1載體用醋酸鋰法[15]轉(zhuǎn)化釀酒酵母 Δyor1，在營(yíng)養(yǎng)缺陷SC-U培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，通過PCR和酶切的方法驗(yàn)證。

圖1 pYES2-BcAUR1載體構(gòu)建圖譜Fig. 1 Map of construction of pYES2-BcAUR1 vector. BcAUR1’ indicates BcAUR1 with FLAG-tag.

挑單克隆至20 mL SC-U培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩孵育30 h，取5 mL提取mRNA，使用RT-PCR試劑盒 (TaKaRa公司)和正向引物F、反向引物R進(jìn)行 PCR檢測(cè)，證明轉(zhuǎn)化后的酵母可以正常轉(zhuǎn)錄。將剩余菌液離心除去上清液，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基將OD600調(diào)整到0.4，然后30 ℃振蕩孵育12 h，離心，將酵母轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)到誘導(dǎo)培養(yǎng)基下誘導(dǎo)12 h，表達(dá)目的基因。

1.7 微粒體的提取

參照Burke等方法[16]進(jìn)行，取5 mL培養(yǎng)液在 4 ℃下 1 500×g 離心 5 min，棄上清。用 500 μL無菌水重懸細(xì)胞，離心，棄上清。用玻璃珠裂解法提取酵母的總蛋白，然后100 000×g超速離心1 h，棄上清，沉淀即為微粒體蛋白。

1.8 Western blotting分析

參照Mersich 和Jungbauer的方法[17]進(jìn)行，將微粒體重新溶解在分析緩沖液中，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，置于1%脫脂奶粉封閉緩沖液中，室溫封閉2 h。將封閉后的膜浸入1%脫脂奶粉緩沖液稀釋的一抗緩沖液中，室溫下緩慢搖動(dòng)1 h；洗膜4次后，將膜浸入用1%脫脂奶粉緩沖液稀釋的二抗中，室溫下緩慢搖動(dòng)1 h；洗膜4次后，用濾紙吸干膜表面。使用ECL試劑盒進(jìn)行顯色。

1.9 IPC合成酶活性的測(cè)定

IPC合成酶活性的測(cè)定參照 Zhong等[18]的方法進(jìn)行，以 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)、10 mmol/L EDTA、150 mmol/L NaCl、10%甘油和2 mmol/L CHAPS配制成反應(yīng)緩沖液；向反應(yīng)緩沖液中加入兩種底物 C6-NBD-Cer和 PI，C6-NBD-Cer的終濃度為0.1 mmol/L、PI終濃度為 2 mmol/L，最后加入微粒體終濃度為0.1 mg/mL。反應(yīng)混合液50 μL置于30 ℃水浴中30 min，加入10%的乙酸終止反應(yīng)。1 000×g離心3 min，取10 μL進(jìn)行HPLC。色譜條件：C18的反向色譜柱(25 cm×4.6 mm)，熒光波長(zhǎng)：λex=465 nm，λem=530 nm，流速 1 mL/min，洗脫梯度50% CH3CN-50% H2O (0.1%CH3COOH)到90% CH3CN-10% H2O (0.1% CH3COOH)，然后用100% CH3CN洗柱10 min。以熒光底物C6-NBD-Cer的高效液相保留時(shí)間 (26 min)為對(duì)照，確定產(chǎn)物IPC的保留時(shí)間為17 min，根據(jù)生成IPC的產(chǎn)物峰面積計(jì)算IPC合成酶活力。

1.10 AbA抗性的檢測(cè)

空載 pYES2酵母轉(zhuǎn)化子和 pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子，在AbA濃度分別是0.002、0.005、0.02、0.05、0.2和 0.5 μg/mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 AUR1基因的克隆和穿梭表達(dá)載體構(gòu)建

從灰葡萄孢菌中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA后，利用含有FLAG標(biāo)簽以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)的AUR1特異引物擴(kuò)增BcAUR1基因，得到1 000 bp左右的電泳條帶，該條帶與AUR1基因大小一致 (圖2)，目的條帶連接到pMD18-T載體上，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，灰葡萄孢菌AUR1 (BcAUR1)的cDNA序列與GenBank的序列比較有3個(gè)堿基發(fā)生變化，但它們未導(dǎo)致氨基酸改變?；移咸寻鶬PC合成酶基因由1 135個(gè)核苷酸構(gòu)成，其中117～231位核苷酸序列為115 bp的內(nèi)含子，IPC合成酶基因編碼339個(gè)氨基酸。將BcAUR1基因與穿梭質(zhì)粒pYES2重組，得到pYES2-BcAUR1轉(zhuǎn)化DH5α，挑取陽(yáng)性克隆菌株，提取 pYES2-BcAUR1質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)驗(yàn)證BcAUR1沒有突變后，利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母Δyor1中，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選，挑取單克隆進(jìn)行菌落 PCR和酶切鑒定，得到3個(gè)pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子。

圖2 AUR1基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Amplification of the gene AUR1. M: DNA marker. 1?2: BcAUR1.

2.2 pYES2-BcAUR1誘導(dǎo)表達(dá)和 Western blotting鑒定

空載 pYES2酵母轉(zhuǎn)化子和 3個(gè) pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子在半乳糖培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，RT-PCR結(jié)果表明空載pYES2酵母轉(zhuǎn)化子不表達(dá)，3個(gè) pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子均有BcAUR1基因表達(dá)，說明BcAUR1基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果也顯示空載pYES2酵母轉(zhuǎn)化子不表達(dá) BcAUR1蛋白(AUR1p)，而3個(gè)pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子有BcAUR1蛋白表達(dá)，并且BcAUR1蛋白均呈現(xiàn)兩條帶，推測(cè)可能分子量小的是未修飾的AUR1p，分子量大的是修飾后的AUR1p (圖3)。

2.3 AbA對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖4 在不同ABA濃度下酵母轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況Fig. 4 The growing state of the yeast transformants under different concentrations of AbA. A?F: the different concetrtion of AbA 0.002, 0.005, 0.02, 0.05, 0.2, 0.5 μg/mL respectively. 1?2: the yeast transformants without BcAUR1.3?4: the yeast transformants 1 with pYES2-BcAUR1. 5?6: the yeast transformants 2 with pYES2-BcAUR1. 7?8: the yeast transformants 3 with pYES2-BcAUR1.

空載 pYES2酵母轉(zhuǎn)化子和 3個(gè) pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子，在不同AbA濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng) (圖4)，當(dāng)AbA濃度達(dá)到0.05 μg/mL，空載pYES2酵母轉(zhuǎn)化子不能生長(zhǎng)，而3個(gè)pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子均能生長(zhǎng)。當(dāng) AbA濃度為0.2 μg/mL時(shí)，只有pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子3能夠生長(zhǎng)，pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子1和2不能生長(zhǎng)。該結(jié)果說明AbA濃度為0.05 μg/mL可抑制酵母生長(zhǎng)。3個(gè)pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子的AbA抗性高于空載pYES2酵母轉(zhuǎn)化子，并且pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子3抗性較強(qiáng)，這是由于灰葡萄孢菌的 AUR1基因在酵母中表達(dá)導(dǎo)致了對(duì)AbA抵抗。

2.4 IPC合成酶活性測(cè)定

以C6-NBD-Cer (熒光的底物)和PI (磷脂酰肌醇)為底物，加入微粒體 (含IPC合成酶)，用高效液相層析熒光光譜檢測(cè)熒光產(chǎn)物IPC的量，根據(jù)生成 IPC的產(chǎn)物峰面積計(jì)算 IPC合成酶活力。通過測(cè)定空載 pYES2酵母轉(zhuǎn)化子和 3個(gè)pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子的IPC合成酶活性，表明3個(gè)pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子IPC合成酶活性高于空載pYES2酵母轉(zhuǎn)化子 (表2)，證實(shí)了灰葡萄孢菌的 AUR1基因在酵母中表達(dá)，pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子3酶活性最高，它的 AbA抗性較強(qiáng)，這與上述 pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子3在較高AbA濃度下仍能生長(zhǎng)結(jié)果一致。

表2 IPC合成酶活性測(cè)定Table 2 Determination of IPC synthase activity

3 討論

肌糖磷脂酰神經(jīng)酰胺 (IPC)合成酶催化鞘脂合成代謝的一個(gè)重要反應(yīng)，即催化神經(jīng)酰胺和磷脂酰肌醇生成肌糖磷脂酰神經(jīng)酰胺，在此基礎(chǔ)上肌糖磷脂酰神經(jīng)酰胺進(jìn)一步形成鞘脂類物質(zhì)，這些物質(zhì)廣泛參與多種生理過程如細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、分化、衰老等過程。酵母的IPC合成酶是由 401個(gè)氨基酸組成的疏水蛋白 (AUR1p或IPC1p)，包含幾個(gè)跨膜域和至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)[9]。其他真菌如構(gòu)巢曲霉的IPC合成酶具有與酵母相似的特點(diǎn)和性質(zhì)[9,13]，目前對(duì)灰葡萄孢菌IPC合成酶的研究較少，本研究首次在釀酒酵母中表達(dá)了灰葡萄孢菌 AUR1基因 (BcAUR1)和IPC1p。Western blotting分析結(jié)果顯示灰葡萄孢菌的IPC1p有兩條帶，這可能是由于IPC合成酶糖基化修飾所致[13]，因?yàn)榧?xì)胞中翻譯和修飾不同步，先合成的AUR1p經(jīng)加工過程被糖基化，而剛合成出來的AUR1p還未經(jīng)糖基化修飾。

AbA是一種環(huán)九肽抗生素[19]，對(duì)白假絲酵母 Candida albicans、新型隱球菌 Cryptococcus neoformans、曲霉Aspergillus等病原真菌都有很強(qiáng)的殺菌作用[20]。AbA的殺菌作用很可能是先被細(xì)胞吸收，抑制IPC合成酶的活性，使神經(jīng)酰胺到肌糖磷脂酰神經(jīng)酰胺的合成受阻，導(dǎo)致鞘磷脂類物質(zhì)的合成量不足，細(xì)胞膜產(chǎn)生斷裂，造成細(xì)胞內(nèi)的糖原泄露[21]。已有研究表明 AbA是真菌IPC合成酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，AbA可通過抑制IPC合成酶抑制真菌生長(zhǎng)[18]。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了AbA能抑制真菌生長(zhǎng)，低濃度的AbA能抑制空載 pYES2酵母轉(zhuǎn)化子，但不影響 pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)，并且酵母轉(zhuǎn)化子的平均酶活力高于空載 pYES2酵母轉(zhuǎn)化子，也說明IPC合成酶的高表達(dá)能夠抵消抑制劑AbA的作用。這是由于抑制劑的濃度不變時(shí)，增加酶活力，減輕了抑制劑對(duì)酶抑制，因此真菌生長(zhǎng)不受影響。pYES2-BcAUR1酵母轉(zhuǎn)化子3在AbA濃度高于空載pYES2酵母轉(zhuǎn)化子4倍時(shí)仍能生長(zhǎng)，而且酶活力在3個(gè)轉(zhuǎn)化子中最高，進(jìn)一步證實(shí)了IPC合成酶活力增加能抵抗AbA對(duì)真菌生長(zhǎng)的抑制。

本研究在酵母中成功表達(dá)了灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶，并且對(duì) AbA影響菌體生長(zhǎng)和酶活性進(jìn)行了初步分析，這對(duì)于進(jìn)一步研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶結(jié)構(gòu)與功能具有十分重要的意義。

[1]Hannun YA, Obeid LM. Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9(2): 139?150.

[2]Colombaioni L, Garcia-Gil M. Sphingolipid metabolites in neural signalling and function. Brain Res Rev, 2004, 46(3): 328?355.

[3]Dickson RC, Lester RL. Shpingolipid functions in Saccharomyces cerebisiae. Biochim Biophys Acta,2002, 1583(1): 13?25.

[4]Dickson RC, Sumanasekera C, Lester RL.Functions and metabolism of sphingolipids in Saccharomyces cerevisiae. Prog Lipid Res, 2006,45(6): 447?465.

[5]Obeid LM, Okamoto Y, Mao C. Yeast sphingolipids: metabolism and biology. Biochim Biophys Acta, 2002, 1585(2/3): 163?171.

[6]Mina JG, Pan SY, Wansadhipathi NK, et al. The Trypanosoma brucei sphingolipid synthase, an essential enzyme and drug target. Mol Biochem Parasitol, 2009, 168(1): 16?23.

[7]Amselem J, Cuomo CA, van Kan JA, et al.Genomic analysis of the necrotrophic fungal pathogens Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea. PLoS Genet, 2011, 7(8): e1002230.

[8]Heidler SA, Radding JA. Inositol phosphoryl transferases from human pathogenic fungi. Biochim Biophys Acta, 2000, 1500(1): 147?152.

[9]Kuroda M, Hashida-Okado T, Yasumoto R, et al.An aureobasidin A resistance gene isolated from Aspergillus is a homolog of yeast AUR1, a gene responsible for inositol phosphorylceramide (IPC)synthase activity. Mol Gen Genet, 1999, 261(2):290?296.

[10]Cerantola V, Guillas I, Roubaty C, et al.Aureobasidin A arrests growth of yeast cells through both ceramide intoxication and deprivation of essential inositol phosphoryl ceramides. Mol Microbiol, 2009, 71(6): 1523?1537.

[11]Venable ME, Webb-FroehIich LM, Sloan EF, et al.Shift in sphingolipid metabolism leads to an accumulation of ceramide in senescence. Mech Ageing Dev, 2006, 127(5): 473?480.

[12]Kim HJ, Oh JE, Kim SW, et al. Ceramide induces p38 MAPK-dependent apoptosis and Bax translocation via inhibition of Akt in HL-60 cells.Cancer Lett, 2008, 260(1/2): 88?95.

[13]Hashida-Okado T, Ogawa A, Endo M, et al. AUR1,a novel gene conferring aureobasidin resistance on Saccharomyces cerevisiae: a study of defective morphologies in Aur1p-depleted cells. Mol Gen Genet, 1996, 251(2): 236?244.

[14]Endo M, Takesako K, Kato I, et al. Fungicidal action of aureobasidin A, a cyclic depsipeptide antifungal antibiotic, against Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother, 1997,41(3): 672?676.

[15]Gietz RD, Woods RA. Transformation of yeast by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Methods Mol Biol, 2006, 313: 107?120.

[16]Burke D, Dawson D, Stearns T. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000.

[17]Mersich C, Jungbauer A. Generic method for quantification of FLAG-tagged fusion proteins by a real time biosensor. J Biochem Bioph Methods,2007, 70(4): 555?563.

[18]Zhong WY, Murphy DJ, Georgopapadakou NH.Inhibition of yeast inositol phosphorylceramide synthase by aureobasidin A measured by a fluorometric assay. FEBS Lett, 1999, 463(3):241?244.

[19]Shimizu T, Kinoshita H, Nihira T. Development of transformation system in Monascus purpureus using an autonomous replication vector with aureobasidin A resistance gene. Biotechnol Lett,2006, 28(2): 115?120.

[20]Denny PW, Shams-Eldin H, Price HP, et al. The protozoan inositol phosphorylceramide synthase: a novel drug target that defines a new class of sphingolipid synthase. J Biol Chem, 2006, 281(1):28200?28209.

[21]Liu XP. Inhibition effect of postharvest pathogens fungi of fruit by aureobasidin A [D]. Xinjiang:Xinjiang University, 2010.劉小平. 短梗霉素A對(duì)水果產(chǎn)后病原真菌的抑制作用[D]. 新疆: 新疆大學(xué), 2010.