李東華，葉春苗

(1.沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110142;2.遼陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工系，遼寧 遼陽 111000)

蘿卜又名萊菔，是十字花科(Cruciferous)植物的一種，在中國根菜類蔬菜中，占有極為重要的地位［1－3］，其硫代葡萄糖苷含量非常豐富，硫代葡萄糖苷是十字花科蔬菜中重要的次生代謝產(chǎn)物，到目前為止已發(fā)現(xiàn)有近120 種［4－5］，廣泛存在于十字花科植物如蘿卜、甘藍、黑芥子和辣根等中.據(jù)資料報道蔬菜在破碎時硫苷可被內(nèi)源芥子酶(myrosinase)水解成異硫氰酸酯鹽.異硫氰酸酯鹽是抗癌效果較好的生物活性物質(zhì)之一，具有較強的抗菌、抗氧化作用.

目前對于硫苷活性的研究主要集中在提取、純化、活性研究等方面，對硫苷的各種研究都要以提取為前提，因此很多學(xué)者致力于高提取率的硫苷成分的研究，李潔，譚正林等［6］利用正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計方法進行水提硫苷，提取液濃度可達到0.9 g/L以上，但這種方法的影響因素較多，分析過程也較復(fù)雜.本實驗擬尋找一種簡單、方便的提取方法，利用超聲波輔助，以水為提取劑，通過正交實驗優(yōu)化蘿卜籽硫苷的提取工藝，并對粗提物的抑菌效果做了探討，為蘿卜籽中硫苷的抗菌研究奠定一定的理論基礎(chǔ).

1 實驗部分

1.1 實驗材料

蘿卜種子(購買于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)種子公司)進行消毒處理，具體方法為:用體積分數(shù)75 %的酒精沖洗2 次消毒，然后用無菌去離子蒸餾水清洗2 次，置于干燥箱(40 ℃)烘干，備用［7］.

將滅菌烘干處理的蘿卜種子置于干燥箱內(nèi)，在90 ℃下烘2 h，使蘿卜種子中的硫代葡萄糖苷酶失活，再用粉碎機粉碎，過40 目篩，以石油醚脫脂，烘干，密封備用.

1.2 實驗方法

1.2.1 真菌的分離提取與繼代繁殖方法

實驗菌種從腳癬、手癬患者身上直接取樣.首先用酒精對患癬部位消毒，接著用滅菌棉棒沾取患癬部位的膿水，涂于土豆培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)4 d 后從長滿菌落的平板上刮取部分菌落，置于20 mL 無菌去離子蒸餾水中，搖勻過濾菌絲，菌液涂布在土豆培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)4 d 左右用劃線法分離菌株，結(jié)果見圖1 和圖2.

根據(jù)資料顯示引起手足癬的菌株主要為紅色發(fā)癬菌(Trichophyfon purpureatum)，本實驗中篩選出來的菌種呈現(xiàn)紅色，基本表現(xiàn)出紅色發(fā)癬菌的特征，故可作為抑菌實驗的研究對象［8－9］.

圖1 劃線法分離菌株Fig.1 Fungus bacterial strain

圖2 菌懸液Fig.2 Fungus suspension inoculation

1.2.2 硫苷的提取方法

在一定溫度、料液質(zhì)量比、時間、超聲功率等條件下，采用水提法進行硫苷提取工藝研究.

1.2.3 蘿卜籽中硫苷含量的測定方法

準確稱取蘿卜籽粉末100 mg，移入10 mL具塞刻度試管中，沸水浴中干蒸10 min，加沸蒸餾水6～8 mL，再蒸煮30 min.取出冷卻后定容至10 mL 過濾.取濾液2 mL 于10 mL 比色管，加4 mL 質(zhì)量分數(shù)0.15 %的羧甲基纖維素鈉，搖勻后再加2 mL 濃度為8 mmol/L 的氯化鈀顯色溶液，在(22 ±3)℃放置2 h，在紫外可見分光光度計540 mm 處以氯化鈀-羧甲基纖維素鈉空白溶液作為參比溶液，測其吸光度.

1.3 水提硫苷法提取條件的設(shè)定

1.3.1 溫度對硫苷提取效率的影響

稱取5 份0.2 g 脫脂蘿卜籽粉末，加入20 mL 水置于150 mL 三角瓶中，分別在20、30、40、50、60 ℃的60 W 超聲波條件下提取15 min，3 000 r/min離心15 min，過濾，取濾液2 mL 測定硫苷含量.

1.3.2 破碎時間對硫苷提取效率的影響

稱取8 份0.2 g 脫脂蘿卜籽粉末，加入20 mL 水置于150 mL 三角瓶中，分別在20 ℃、60 W 的超聲輔助下，提取5、15、25、35、45、55、65、75 min，3 000 r/min 離心15 min，過濾，取濾液2 mL 測定硫苷含量.

1.3.3 水料質(zhì)量比對硫苷提取效率的影響

稱取5 份1.0 g 脫脂蘿卜籽粉末分別加入10、15、20、25、30 mL 水置于150 mL 三角瓶中，在40℃，60 W 超聲波下提取25 min，3 000 r/min離心15 min，過濾，取濾液2 mL 測定硫苷含量.

1.3.4 超聲波功率對硫苷提取效率的影響

稱取6 份2.0 g 脫脂蘿卜籽粉末，加入20 mL 水置于150 mL 三角瓶中，溫度為40 ℃，分別在40、50、60、70、80、90 W 的超聲輔助下提取30 min，3 000 r/min 離心15 min，過濾，取濾液2 mL測定硫苷含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

準確稱取硫苷含量分別為10 μmol/g、20 μmol/g、30 μmol/g、40 μmol/g、50 μmol/g 的標準液100 mg 于10 mL 具塞刻度試管中，采用氯化鈀比色法測定吸光值，以硫苷含量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線［10］，如圖3 所示.

硫苷標準曲線:

A=0.004 9c+0.035 6.

圖3 硫苷含量標準曲線的制作Fig.3 Standard curve of glucosinolates content

2.2 蘿卜籽中硫苷最佳提取條件確定

單因素實驗確定破碎溫度為40 ℃時，破碎時間30 min，加水量為15 mL/g，超聲功率為60 W 時，提取效果達到最佳.根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，選用L(34)正交設(shè)計表(見表1)進行正交實驗，結(jié)果見表2.由表2 可知，按照極差R 的大小，影響種子中硫苷提取率的因素主次順序為B＞C ＞D ＞A，即水料質(zhì)量比＞提取溫度＞提取時間＞超聲波功率;根據(jù)K 值可知因素最優(yōu)組合條件為A3B1C3D2，即超聲波功率70 W、破碎時間30 min、破碎溫度40 ℃、水料質(zhì)量比為15.

為進一步判斷上述4 類受控制的因素對實驗結(jié)果的影響是否存在，運用DPS 數(shù)據(jù)處理軟件對正交實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，找出這些因素中起主導(dǎo)作用的變異來源［11－12］.由表3 可知，4因素對硫苷提取率的影響都很顯著(P ＜0.05)，其中B、C 的影響最顯著，其次是D、A，證明正交實驗設(shè)計正確合理，綜上所述，實驗最終確定的提取條件為:A3B1C3D2.

表1 L9(34)因素水平表Table 1 Factors and levels of test

表2 正交結(jié)果處理表Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交實驗方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.3 抑菌實驗

實驗分別在正交實驗獲得的最優(yōu)提取方案A3B1C3D2(硫苷含量65.59 μmol/g)、任意兩組組合A2B2C2D3(硫苷含量57.22 μmol/g)和A1B1C2D2(硫苷含量50.9 μmol/g)條件下進行硫苷的提取，研究提取液的抑菌效果.在混菌平板上分別加入上述3 個提取條件下的提取液100 μL，在28 ℃下培養(yǎng)4 d，抑菌效果見圖4～圖7.

圖4 水(對照)Fig.4 Water(control experiment)

圖5 A1B1C2D2的抑菌效果Fig.5 Inhibitory effect of A1B1C2D2group

圖6 A2B2C2D3的抑菌效果Fig.6 Inhibitory effect of A2B2C2D3group

圖7 A3B1C3D2(最優(yōu))抑菌效果Fig.7 Inhibitory effect of A3B1C3D2group

實驗初步測量圖4～圖7 的抑菌圈直徑大小，分別為0 cm、0.75 cm、0.82 cm、1.54 cm，由此可知蘿卜種子提取液的抑菌活性隨硫代葡萄糖苷的含量增加而增加，蘿卜種子中的抑菌活性與硫代葡萄糖苷的含量有直接關(guān)系，蘿卜種子提取液的抑菌效果在正交最優(yōu)方案下提取液中硫代葡萄糖苷的含量達到最大，抑菌效果也達到最好.

3 結(jié)論

以脫脂的烘干蘿卜籽粉末為原料，采用超聲波輔助加熱的方法提取蘿卜種子中的活性成分，通過正交實驗的結(jié)果可得:影響種子中硫苷提取率的因素主次順序為B ＞C ＞D ＞A，即水料質(zhì)量比＞提取溫度＞提取時間＞超聲波功率;根據(jù)K值可知4 因素最優(yōu)組合條件為A3B1C3D2，即超聲波功率70 W、破碎時間30 min、破碎溫度40℃、水料質(zhì)量比15.

蘿卜種子提取液的抑菌活性隨硫代葡萄糖苷的含量增加而增加，蘿卜種子中的抑菌活性與硫代葡萄糖苷的含量有直接關(guān)系，蘿卜種子提取液的抑菌效果在正交最優(yōu)化的方案下提取液中硫代葡萄糖苷的含量達到最大，抑菌效果也達到最好.

實驗還有一定的不足之處:①蘿卜種子內(nèi)含物中還有糖類、醇類等成分對硫代葡萄糖苷提取的影響沒有做進一步的研究;②在本實驗中硫代葡萄糖苷的提取只屬于初步的提取，硫代葡萄糖苷的純化、精制還待進一步研究;③在抑菌試驗中硫代葡萄糖苷的抑菌機理及抑菌的持久性還待進一步研究.

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