劉 博，尹 航，高文惠

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

殺菌劑的使用在中國農(nóng)業(yè)種植過程中擔(dān)當(dāng)了越來越重要的作用，使用量和使用面積逐年增加。烯唑醇和戊唑醇屬于三唑類殺菌劑。這類殺菌劑具有高效、廣譜、內(nèi)吸性的特點(diǎn)，其防治病菌的機(jī)理主要是它們能抑制菌體細(xì)胞膜上麥角甾醇的去甲基化，從而使病菌無法形成細(xì)胞膜，進(jìn)而殺死病菌。這些三唑類殺菌劑對生物體有以下危害：1)損害神經(jīng)系統(tǒng)；2)使機(jī)體的生殖機(jī)能下降或產(chǎn)生異?，F(xiàn)象；3)降低生物體的免疫能力并誘發(fā)腫瘤。

分子印跡技術(shù)現(xiàn)在越來越多地被用于食品中有害物質(zhì)的檢測中，主要研究內(nèi)容有新模板物質(zhì)開發(fā)[1-2]、功能單體選擇等。近幾年分子印跡技術(shù)得到了快速發(fā)展，主要因?yàn)榉肿佑≯E技術(shù)具有特異性選擇、可反復(fù)使用、耐苛刻條件、簡化前處理、制作簡單等優(yōu)點(diǎn)[3]。其廣泛應(yīng)用于化學(xué)仿生傳感器[4-6]、模擬酶催化[7-10]、固相萃取技術(shù)[11-21]等領(lǐng)域。

虛擬模板技術(shù)是利用與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)類似的模板物質(zhì)進(jìn)行合成，利用所得聚合物對目標(biāo)物質(zhì)分離富集。采用虛擬模板技術(shù)合成分子印跡聚合物有效地降低了合成過程中的毒性和成本，還能避免模板泄露導(dǎo)致的定量不準(zhǔn)確問題，而又能達(dá)到對目標(biāo)物的高吸附效果[1]。

本文采用本體聚合法自制了聯(lián)苯三唑醇分子印跡聚合物(MIP)，以此聚合物為固相萃取劑，制備固相萃取柱，對果蔬中烯唑醇、戊唑醇進(jìn)行分離富集，并采用高效液相色譜法測定其在果蔬中的殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

聯(lián)苯三唑醇(純度為99%，上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供)；烯唑醇(純度為98%，北京金寶在線科技有限公司提供)；戊唑醇(純度為98%，北京金寶在線科技有限公司提供)；甲醇、乙腈(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供)；α-甲基丙烯酸酯(MAA，分析純，天津市化學(xué)試劑一廠提供，使用前需要重蒸以除去阻聚劑)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，分析純，撫順安信化學(xué)有限公司提供)；偶氮二異丁腈(AIBN，化學(xué)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供)。

LC-20A高效液相色譜儀，配紫外檢測器(日本島津公司提供)；SHZ-82A型恒溫水浴振蕩器(江蘇省太倉醫(yī)療器械廠提供)；ASE-12固相萃取儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司提供)；KH5200型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供)。

1.2 分子印跡聚合物制備

實(shí)驗(yàn)室自制分子印跡聚合物：將0.2 mmol聯(lián)苯三唑醇和0.8 mmol的α-甲基丙烯酸酯(MAA)放入50 mL的安瓿瓶中，加致孔劑使其反應(yīng)，超聲1 h，振蕩30 min后，再加交聯(lián)劑EDMA和引發(fā)劑AIBN。超聲30 min，混勻后通入N2脫氧15 min后，抽真空1 min后密封，在恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，得塊狀固體MIP。經(jīng)研磨、粉碎，過200目(75 μm)篩，再用去離子水沉降聚合物3次除去過細(xì)粉末。將最終得到的MIP顆粒用甲醇-乙腈(體積比為95∶5)洗脫至無模板分子，最后用甲醇浸泡1 h除去殘留的乙酸，洗脫后的聚合物放入真空干燥器中(45 ℃)干燥6 h，得到聯(lián)苯三唑醇模板聚合物MIP。

1.3 固相萃取柱制備

將研磨后過200目(75 μm)篩的分子印跡聚合物裝填入內(nèi)徑為1.5 cm、長為15 cm的具砂芯層析管，層析管有效分離區(qū)域高2 cm，在上端加2 cm高的脫脂棉，輕輕擠壓使柱子填充緊實(shí)。

1.4 色譜條件

色譜柱：安捷倫C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，檢測波長為230 nm，流動相為甲醇-水(體積比為70∶30)，流速為1 mL/min，柱溫箱溫度為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.5 樣品前處理

分別稱取5.00 g蘋果和白菜樣品，搗碎，加6 g無水硫酸鈉，用20 mL乙腈溶解，混勻，超聲15 min，于4 000 r/min離心10 min，吸取上清液過分子印跡固相萃取柱，用三蒸水20 mL淋洗，待排凈淋洗液后，用10 mL甲醇洗脫[19]，收集洗脫液待檢。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡固相萃取柱對樣品凈化和檢測效果

分子印跡固相萃取柱利用非共價鍵對目標(biāo)物吸附，通過淋洗液將雜質(zhì)去除，最后利用洗脫液將目標(biāo)物洗脫下來。淋洗液的量對樣品凈化起到至關(guān)重要的作用，若淋洗液量少，會導(dǎo)致洗脫后洗脫液的液相色譜圖出峰復(fù)雜，干擾分析。分別測試了5～20 mL 4個淋洗液用量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 mL淋洗液可將雜質(zhì)全部洗去。從圖1和圖2對比可知聯(lián)苯三唑醇分子印跡固相萃取柱對樣品凈化效果明顯。從圖3可知，其對結(jié)構(gòu)類似物烯唑醇和戊唑醇具有選擇性的吸附作用，從而表現(xiàn)了它從復(fù)雜基質(zhì)條件下分離富集目標(biāo)物的優(yōu)越性能。

圖1 蘋果原液色譜圖Fig.1 Sample chromatograms of apples stock solution

圖2 蘋果樣品過柱后色譜圖Fig.2 Chromatograms of effluent aftersample cross SPE column

1-戊唑醇；2-烯唑醇圖3 蘋果加戊唑醇和烯唑醇后過柱洗脫液色譜圖Fig.3 Sample solution added standard after passing SPE column

2.2 分子印跡聚合物對結(jié)構(gòu)類似物的識別作用

由于形成分子印跡聚合物的模板物質(zhì)聯(lián)苯三唑醇分子中存在著帶有孤對電子的N原子，其電負(fù)性較大，能和羧基中的H原子形成氫鍵，由此可推測模板分子與功能單體MAA的作用形式。烯唑醇和戊唑醇以及聯(lián)苯三唑醇都屬于三唑類殺菌劑，它們在結(jié)構(gòu)上都有三唑環(huán)，有帶孤對電子的N原子，化學(xué)結(jié)構(gòu)式類似(見圖4)，所以聯(lián)苯三唑醇分子印跡聚合物能夠?qū)ο┻虼己臀爝虼嘉?，形成非共價鍵結(jié)合而產(chǎn)生識別作用。

圖4 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structural formula

2.3 線性范圍與檢測限

將烯唑醇和戊唑醇分別配制成質(zhì)量濃度為0.25，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200 μg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.4色譜條件下繪制烯唑醇和戊唑醇的線性關(guān)系曲線，其線性關(guān)系和檢測限見表1。

表1 烯唑醇和戊唑醇的線性關(guān)系及檢測限Tab.1 Linear equation and detection limit of tebuconazole and diniconazole

2.4 方法回收率和精密度

采用本方法對果蔬樣品在10 μg/g和為100 μg/g 2個烯唑醇和戊唑醇添加水平下，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果如表2所示，烯唑醇平均回收率為74.6%～88.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%～3.7%(n=5)。戊唑醇平均回收率為66.9%～73.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～3.1%(n=5)。說明方法的回收率和精密度良好。

表2 果蔬的回收率實(shí)驗(yàn)(n=5)Tab.2 Recovery of fruit and vegetable(n=5)

3 結(jié) 論

采用本體聚合法自制了聯(lián)苯三唑醇分子印跡聚合物(MIP)，以此聚合物為固相萃取劑，制備固相萃取柱，對果蔬中烯唑醇和戊唑醇進(jìn)行分離富集，并采用高效液相色譜法測定其在果蔬中的殘留。結(jié)果表明，利用此印跡聚合物對樣品進(jìn)行前處理，其凈化效果好。烯唑醇線性范圍為1～200 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，樣品平均回收率為74.6%～88.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%～3.7%(n=5)，檢測限為0.5 μg/mL。戊唑醇線性范圍為0.5～200 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，樣品平均回收率為66.9%～73.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～3.1%(n=5)，檢測限為0.25 μg/mL。

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