苗華 張旭

西北大學(xué)體育教研部（陜西西安710069）

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的一部分，是通過測(cè)定生物體分泌的各種體液內(nèi)代謝物的組成變化來(lái)認(rèn)識(shí)和反映生物體代謝網(wǎng)絡(luò)在藥物和疾病作用下的變化規(guī)律，這對(duì)于揭示藥物的代謝模式和復(fù)雜性疾病的機(jī)理具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、藥物毒性評(píng)價(jià)、臨床診斷等領(lǐng)域［1-3］。血脂紊亂是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一?？偰懝檀迹═C）、甘油三酯（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平增高及血漿高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平的下降與心血管疾病密切相關(guān)［4］。文獻(xiàn)報(bào)道中草藥茯苓可用于糾正血脂紊亂［5］。由于有氧運(yùn)動(dòng)可顯著降低血清TC、LDL-C等水平，并可減輕動(dòng)脈粥樣硬化的臨床表現(xiàn)［6，7］，將茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)，對(duì)血脂紊亂有較好的治療作用［5］。本研究以大鼠為對(duì)象，探討茯苓乙醇提取物及聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)性血脂紊亂的干預(yù)作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠40只（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（陜）2008-03；動(dòng)物批號(hào)201212006；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK 2010-004），隨機(jī)分成5組，每組8只。A組（正常對(duì)照組）普通飼料喂養(yǎng)；B組（模型組）高脂飼料（高脂飼料配方：81%基礎(chǔ)飼料，10%蛋黃粉，7.5%豬油，0.3%膽鹽，0.2%甲基硫氧嘧啶，1%膽固醇［8］）喂養(yǎng)；C組（茯苓組）高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)灌胃茯苓乙醇提取物10 g生藥/kg/d；D組（有氧運(yùn)動(dòng)組）高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練；E組（茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組）高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)灌胃茯苓提取物10 g生藥/kg/d，同時(shí)進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練。在實(shí)驗(yàn)開始的第1天、第2周末和第4周末分別稱體重，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為4周。

1.2 茯苓乙醇提取物

茯苓樣品經(jīng)過干燥、粉碎后，5 kg用約10倍體積的95%乙醇浸泡24 h后開始滲漉，回收乙醇，重新利用。濃縮得棕色膏狀物68 g。

1.3 游泳訓(xùn)練

游泳池為圓形，內(nèi)壁光滑，直徑45 cm，水深70 cm，水溫25～35°C。運(yùn)動(dòng)組大鼠每天無(wú)負(fù)重條件下游泳2 h，周六、日休息，共4周。

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)開始第1天和第2周末對(duì)大鼠進(jìn)行眼靜脈叢取血。第4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，4℃，3000 r/min離心10 min，得上層血清。采用Olympus AU640自動(dòng)生化儀測(cè)定TC、TG、HDL-C及LDL-C等指標(biāo)；采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測(cè)定血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）。

1.5 代謝組學(xué)測(cè)定

美國(guó)Waters AcquityTM液相色譜儀；美國(guó)XevoTMQTof質(zhì)譜儀；MassLynx V4.1工作站；Acquity UPLC HSS T3色譜柱；流動(dòng)相為0.1%的甲酸乙腈（A）-0.1%的甲酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0～0.5 min，1%B；0.5～3.5 min，1～35%B；3.5～7.0 min，35～99%B；7.0～8.0 min，99%B；8.0～10.0 min，99.0～1.0%B；流速為0.45 ml/min；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 °C；進(jìn)樣量為2 μL。質(zhì)譜條件：ESI正離子模式；毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為3.0 kV和30 V；干燥氣流速800 L/h；干燥氣溫度450 °C。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基于代謝組學(xué)的模型評(píng)價(jià)

無(wú)督導(dǎo)的主成分分析方法在無(wú)先驗(yàn)知識(shí)的情況下通過樣本點(diǎn)在得分圖上的分布反映樣本的分類信息，結(jié)果具有客觀性。血清中不同的代謝產(chǎn)物濃度差別較大，濃度高的物質(zhì)在數(shù)據(jù)模型中的權(quán)重大，這樣不利于低濃度生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，因此在模型擬合前應(yīng)對(duì)數(shù)據(jù)做歸一化處理，以利于發(fā)現(xiàn)不同組間的差別。代謝組學(xué)測(cè)定的血脂紊亂主要相關(guān)性物質(zhì)有山梨醇、酪氨酸、檸檬酸、半乳糖、膽固醇、肌酸、鳥氨酸、脯氨酸等［9］。檸檬酸是體內(nèi)三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物；肌酸是尿中主要非蛋白氮代謝產(chǎn)物之一，其含量與腎功能正常與否關(guān)系密切。血清中HDL-C及LDL-C水平可反映脂類在體內(nèi)的分解與轉(zhuǎn)運(yùn)以及肝臟脂肪代謝情況，體內(nèi)脂肪代謝能力下降而肌酸、酪氨酸、鳥氨酸、脯氨酸等多種氨基酸及肌酸含量改變證明存在能量代謝異常。這些物質(zhì)的變化反映了大鼠出現(xiàn)了糖脂代謝紊亂、免疫功能減弱、凝血功能障礙等一系列的病理變化。圖1A和1B是采用PCA（主成分分析）處理的正常對(duì)照組和模型組結(jié)果，與第2周PCA結(jié)果相比，第4周正常對(duì)照組和模型組之間的距離增大，說明血脂代謝紊亂加重，推斷造模成功。此外，從圖1C也可以看到隨時(shí)間變化血脂代謝紊亂的軌跡，此軌跡也反映了血脂代謝紊亂加重的變化過程。圖2采用PLS-DA（偏最小二乘法判別分析）統(tǒng)計(jì)處理方法研究正常對(duì)照組、模型組與不同干預(yù)組。從圖2可以看到，不論是茯苓組、有氧運(yùn)動(dòng)組，還是茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組都處于正常對(duì)照組和模型組之間。此外，還可以觀察到茯苓組介于正常對(duì)照組和模型組之間，有氧運(yùn)動(dòng)組靠近于模型組，而茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組更靠近正常對(duì)照組。由此可得出以下結(jié)論：（1）血脂紊亂模型成的建立；（2）茯苓、有氧運(yùn)動(dòng)及茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)均對(duì)血脂紊亂有一定的治療作用；（3）茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組治療效果優(yōu)于單一的茯苓組或有氧運(yùn)動(dòng)組。

2.2 各組大鼠體重變化

由表1可知：與正常對(duì)照組相比，模型組在第2、4周體重均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；茯苓組、有氧運(yùn)動(dòng)組及茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組與模型組相比，體重呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同干預(yù)組的體重變化接近于正常對(duì)照組。

表1 各組大鼠體重比較

2.2 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的變化

由表2可知：第2周和第4周，與正常對(duì)照組相比，模型組TC、TG和LDL-C均顯著升高（P<0.01，P<0.001）；HDL-C顯著降低（P<0.01，P<0.001）。與模型組相比，除第2周有氧運(yùn)動(dòng)組TG、第2周茯苓組和有氧運(yùn)動(dòng)組HDL-C、第2周有氧運(yùn)動(dòng)組LDL-C變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，茯苓組、有氧運(yùn)動(dòng)組、茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組TC、TG和LDL-C均顯著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；HDL-C顯著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。

表2 各組大鼠TC、TG、HDL-C及LDL-C比較

2.3 血清SOD、GSH-Px、CAT和MDA的變化

由表3可知：與正常對(duì)照組相比，模型組SOD、GSH-Px均顯著降低（P<0.01，P<0.001），MDA顯著增加（P<0.001）。CAT變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組SOD顯著升高（P<0.05）；茯苓組、有氧運(yùn)動(dòng)組、茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組GSH-Px顯著升高（P<0.01）；茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組CAT顯著升高（P<0.01）；茯苓組以及茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組MDA顯著降低（P<0.01）。

表3 各組大鼠血清SO D、G SH-Px、CA T和M D A比較

3 討論

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的一部分，把生物作為一個(gè)完整的系統(tǒng)來(lái)研究，通過測(cè)定生物體分泌的各種體液內(nèi)代謝物的組成變化來(lái)認(rèn)識(shí)和了解生物體代謝網(wǎng)絡(luò)在藥物和疾病作用下的變化規(guī)律，這對(duì)于揭示藥物的代謝模式和復(fù)雜性疾病的機(jī)理具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［10］。病理過程中代謝網(wǎng)絡(luò)的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂，使細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性產(chǎn)物的種類、濃度、相對(duì)比例發(fā)生擾動(dòng)，這種擾動(dòng)體現(xiàn)在小分子代謝產(chǎn)物集合輪廓的改變。因此通過比較正常組與模型組的代謝產(chǎn)物集合輪廓，可以從中得出兩者內(nèi)源性產(chǎn)物種類、濃度、相對(duì)比例是否處于相同范圍，進(jìn)而推斷造模是否成功。PCA結(jié)果證明在4周的時(shí)間里，血脂紊亂大鼠造模成功。

茯苓用于調(diào)節(jié)血脂的相關(guān)研究已有報(bào)道［11］，藥理研究表明，茯苓水提取液可降低過氧化脂質(zhì)及血清TG、TC、LDL-C，提高HDL-C。本研究發(fā)現(xiàn)茯苓可以降低血清TG、TC、LDL-C，提高HDL-C，這與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致。本研究結(jié)果還顯示，茯苓可以提高機(jī)體SOD、CAT和GSH-Px的活性，同時(shí)抑制MDA的產(chǎn)生，加快其清除，從而有效防止機(jī)體的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改善脂代謝紊亂的進(jìn)展。這種作用可能也和其改變機(jī)體脂代謝的紊亂、調(diào)適機(jī)體的脂蛋白組成密不可分。雖然水提取物和乙醇提取物都能夠改變這些生化指標(biāo)，但是水提取物和乙醇提取物的成分有很大不同，水提取物主要含有多糖等極性較大的成分，而乙醇提取物主要含茯苓素（四環(huán)三萜類化合物）、麥角甾醇等。這兩種提取物是如何促進(jìn)和提高脂質(zhì)代謝水平，改善和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，有待于進(jìn)一步研究。

已有研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂代謝的影響是通過降低血漿中TC、TG等水平、促進(jìn)TG的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解實(shí)現(xiàn)的，且運(yùn)動(dòng)能使膽固醇逆相轉(zhuǎn)運(yùn)能力增加，引起血液中HDL-C的升高和LDL-C的降低，有利于外周血膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，從而改善血脂代謝，緩解心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展［12，13］。

本研究結(jié)果顯示，單純有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)GSH-Px的活性影響較明顯，而沒有顯著降低血清MDA含量，提高SOD和CAT的活力。單一的茯苓僅僅能夠上調(diào)GSHPx和下調(diào)MAD含量，而對(duì)SOD和CAT沒有顯著影響。茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)能顯著上調(diào)血清SOD、GSHPx和CAT含量，同時(shí)顯著下調(diào)血清MDA含量，茯苓結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)比單一的茯苓或有氧運(yùn)動(dòng)能更好改善機(jī)體脂代謝紊亂。藥物與有氧運(yùn)動(dòng)的結(jié)合可能是治療血脂紊亂的一條有效途徑。

4 小結(jié)

茯苓、有氧運(yùn)動(dòng)均能有效調(diào)節(jié)血脂紊亂機(jī)體的脂代謝狀況。兩者聯(lián)合作用效果優(yōu)于單純補(bǔ)充茯苓或有氧運(yùn)動(dòng)。

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