陳渝 卜淑敏

1 首都體育學(xué)院（北京100191） 2 北京體育大學(xué)

女性進(jìn)入絕經(jīng)期后，卵巢功能逐漸衰竭，易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。而絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨量減少時，往往伴隨著骨髓中脂肪組織增多，這種骨量減少與脂肪的增多可能是由于成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞的前體細(xì)胞——骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）向兩者分化發(fā)生改變而產(chǎn)生。去卵巢大鼠是目前通用的模擬研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的理想動物模型［1、2］。研究表明，全身垂直振動能減緩去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠松質(zhì)骨骨量丟失［3，4］，但對其細(xì)胞分子作用機(jī)制還知之甚少。過氧化物酶體增殖物激活 受 體（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）屬核激素受體超家族，含三種亞型（PPARα、PPARγ、PPARδ）［5］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PPARγ表達(dá)可增加BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并抑制其向脂肪細(xì)胞分化［6］，表明PPARγ能誘導(dǎo)BMSCs向脂肪細(xì)胞分化。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthakinase，GSK-3）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在哺乳動物中包括兩個亞型（GSK-3α和GSK-3β）。研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β參與葡萄糖轉(zhuǎn)運、糖異生及脂質(zhì)代謝等的調(diào)節(jié)［7］。Wnt/β-catenin信號途徑活化是BMSCs向成骨細(xì)胞分化的必需條件之一，GSK-3β通過抑制Wnt/β-catenin信號通路下游抑制BMSCs向成骨細(xì)胞分化。GSK-3β磷酸化能抑制自身激酶活性，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號通路下游，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，提示P-GSK-3β具有誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用。鑒此，本實驗建立了去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠動物模型，探討全身垂直振動對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠全骨髓細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞PPARγ和P-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響，為揭示振動防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的細(xì)胞分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Mouse-ant-PPARγ抗體：ZS-7273，中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Rabbit-GSK-3β抗體（#9315S）和Rabbit-P-GSK-3β抗體（#9336S：美國 Cell Signaling TECHNOLOGY）；馬抗小鼠IgG/堿磷酶標(biāo)記二抗、山羊抗兔IgG/堿磷酶標(biāo)記二抗和堿磷酶底物BCIP/NBT顯色濃縮液：中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RIPA蛋白裂解液和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液：P0015，碧云天；DSPT-202振動臺：北京雅士林生產(chǎn)；LG10-3A離心機(jī)：北京離心機(jī)廠；電泳儀：DYY-7C型，北京六一儀器廠。

1.2 動物手術(shù)與分組

3月齡健康雌性未孕SD大鼠36只，體重（260±12）g，由北京維通利華實驗動物中心提供及飼養(yǎng)，動物合格證號SCXK（京）2006-0008。自由飲水和進(jìn)食，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重分層后隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、去卵巢靜止組（OVX）和去卵巢振動組（OVX-V）3個組。手術(shù)前，各組大鼠均禁食12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，OVX組和OVX-V組大鼠從背部切除雙側(cè)卵巢，Sham組不切除卵巢，只切除卵巢旁與卵巢等大的脂肪組織。無菌手術(shù)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部［SYXK（京）2006-0025］進(jìn)行，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷，術(shù)后自由進(jìn)食水。實驗過程中，OVX組2只大鼠因腹部粘連而于術(shù)后2周死亡，最后納入實驗的各組大鼠數(shù)目分別為：Sham組12只，OVX組10只，OVX-V組12只。

1.3 全身垂直振動治療方案

全身垂直振動治療方案參照Tezval等［3］報道并略做修改。術(shù)后休息10周，經(jīng)雙能X線骨密度儀檢測OVX組和OVX-V組大鼠在體腰椎骨密度已顯著低于Sham組大鼠后，第11周開始進(jìn)行1周適應(yīng)性振動訓(xùn)練。振動頻率50 Hz，振幅0.9 mm，每天振動2次，每次間隔10 min，持續(xù)時間10 min，訓(xùn)練7天。第12周開始正式振動，振動頻率90 Hz，振幅0.5 mm，加速度3.8 g，每天振動2次，每次間隔15 min，持續(xù)振動15 min，每周振動7天，共振動7周。所有振動治療均在上午進(jìn)行，各組大鼠同等條件飼養(yǎng)，每周稱量各組大鼠體重1次。

1.4 全骨髓細(xì)胞的沖洗和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)

腹主動脈取血后，處死大鼠，立即浸泡于75%酒精中10 min，無菌條件下取左側(cè)股骨，仔細(xì)除去表面軟組織，采用咬骨鉗咬除股骨兩端，用預(yù)先吸入2 ml培養(yǎng)液的5 ml注射器沖洗骨髓腔，將沖洗液置于刻度離心管中，1000 r/min離心6 min。小心棄上清，一部分細(xì)胞沉淀置于-40℃保存，用于蛋白提?。涣硪徊糠钟? ml含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液懸浮，然后輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，將細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，放入5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第5天輕輕吸出懸浮細(xì)胞，半量換液，以后每2～3天更換培養(yǎng)液1次。

1.5 蛋白提取

在每管全骨髓細(xì)胞中加入1 ml蛋白裂解液和10 μl蛋白酶抑制劑混勻，冰面上作用2 h，4℃、13000 r/min離心30 min，取上清，留一部分檢測蛋白質(zhì)濃度，其余蛋白樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）（按4∶1）混勻，沸水煮5 min，4℃、13000 r/min離心30 min，分裝后-40℃保存。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)9天后用PBS洗2次，加入蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑（100∶1）后用細(xì)胞鏟子將貼壁細(xì)胞鏟入液體中，攪拌混勻。其后操作與提取全骨髓蛋白一致。

1.6 Western blotttiinngg

取40 μg蛋白樣品上樣，以80 V電壓，在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分離約2 h后，以80 V電壓轉(zhuǎn)移2 h。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉中室溫封閉1 h，將PVDF膜與一抗4℃過夜，次日TBST洗10 min×3，分別加二抗室溫孵育2 h，TBST洗10 min×3，在BCIP/NBT顯色液中顯色至條帶出現(xiàn)，放入水中終止顯色，拍照，掃描各條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 全骨髓細(xì)胞PPARγ和P-GSK-33β蛋白表達(dá)

圖2 各組大鼠全骨髓細(xì)胞P-GSK-3β蛋白表達(dá)比較

2.2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞PPARγ和P-GSK-3β蛋白表達(dá)

圖3和圖4顯示，OVX組PPARγ蛋白表達(dá)（0.73±0.04）與Sham組（0.72±0.028）比較無顯著差異，而PGSK-3β表達(dá)（0.82±0.03）與Sham組（0.91±0.10）比較顯著降低；OVX-V組PPARγ（0.77±0.04）和P-GSK-3β蛋白表達(dá)（0.84±0.01）與OVX組（PPARγ：0.73±0.04，PGSK-3β：0.82±0.03）比較均無顯著差異。

圖3 各組大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)比較

圖1和圖2顯示，OVX組PPARγ蛋白表達(dá)（0.64±0.04）與Sham組（0.61±0.02）比較無顯著差異，而PGSK-3β蛋白表達(dá)（0.12±0.02）與Sham組（0.16±0.01）比較顯著降低。OVX-V組PPARγ蛋白表達(dá)（0.60±0.01）與OVX組（0.64±0.04）比較無顯著差異，而PGSK-3β蛋白表達(dá)（0.21±0.01）與OVX組（0.12±0.02）比較顯著增加。

3 討論

骨質(zhì)疏松是女性絕經(jīng)后的常見骨代謝疾病。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與骨髓細(xì)胞向成脂和成骨細(xì)胞分化異常有關(guān)，骨質(zhì)疏松患者骨髓細(xì)胞有部分細(xì)胞被脂肪細(xì)胞取代。BMSCs是一種多功能干細(xì)胞，具有多向分化潛能，能夠向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肌膜細(xì)胞、成脂細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞分化［8-12］。本實驗中，體外培養(yǎng)的OVX組BMSCs的生長狀況及細(xì)胞形態(tài)與Sham組比較無差異，表明去卵巢未改變BMSCs的生長狀況和形態(tài)，這與相關(guān)報道［13］基本吻合。

圖4 各組大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞P-GSK-3β蛋白表達(dá)比較

PPARγ蛋白是一種核轉(zhuǎn)錄受體，在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化過程中起關(guān)鍵作用。林先和等［14］用PPARγ基因轉(zhuǎn)染BMSCs后，細(xì)胞PPARγ表達(dá)呈陽性，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長逐漸停止并進(jìn)入分化階段，最終分化為脂肪細(xì)胞。去卵巢模型研究中，去卵巢小鼠PPARγ基因表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組，8周上坡跑有氧耐力訓(xùn)練后，去卵巢大鼠PPARγ基因表達(dá)量顯著降低［15］。我們前期研究表明［16］，14 周跑臺訓(xùn)練后，去卵巢大鼠股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端骨髓腔脂肪空泡數(shù)目及股骨PPARγ蛋白表達(dá)顯著低于去卵巢靜止組。本實驗中，OVX組大鼠全骨髓細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)量與Sham組大鼠相比雖增加但均無顯著差異。OVX-V組和OVX組大鼠全骨髓細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)同樣無顯著性差異。上述提示，一方面，PPARγ在骨組織和骨髓細(xì)胞中的表達(dá)有部位差異；另一方面，機(jī)械振動可能不能調(diào)節(jié)去卵巢大鼠骨髓細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)。

GSK-3β具有多種生物學(xué)功能，如參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)［7］。GSK-3β的活性受磷酸化調(diào)節(jié)，Ser9位點的磷酸化導(dǎo)致GSK-3β失活，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。在前期研究中，我們證實去卵巢顯著降低大鼠腰椎P-GSK-3β蛋白表達(dá)，而中等強度跑臺運動顯著增加去卵巢大鼠P-GSK-3β蛋白表達(dá)［17］。本實驗中，P-GSK-3β蛋白在去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠全骨髓細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于假手術(shù)組，而全身垂直振動則促進(jìn)去卵巢大鼠全骨髓細(xì)胞P-GSK-3β蛋白表達(dá)。這與前期在骨組織中的研究結(jié)果吻合，表明P-GSK-3β蛋白在骨髓細(xì)胞和骨組織中的表達(dá)無差異，均受振動刺激調(diào)節(jié)。此外，本研究中，去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞P-GSK-3β蛋白表達(dá)顯著低于Sham組，但振動對其無顯著影響。這表明全身垂直振動對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠全骨髓細(xì)胞P-GSK-3β蛋白產(chǎn)生的影響在體外培養(yǎng)后消失，提示探討振動對去卵巢大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞如P-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響不能在體外培養(yǎng)后進(jìn)行。

4 總結(jié)

本實驗結(jié)果表明，全身垂直振動促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓細(xì)胞P-GSK-3β蛋白表達(dá)，但其效應(yīng)在體外培養(yǎng)后消失，提示全身垂直振動可能通過促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠全骨髓細(xì)胞P-GSK-3β蛋白表達(dá)而發(fā)揮其預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的作用。

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