陽麗云 曾漣 莫浪平 韋雄麗

阿片類藥物因其強大的鎮(zhèn)痛作用，在癌痛的治療中起著 非常重要的作用[1]。目前研究認為阿片類藥物除對癌痛患者具有鎮(zhèn)痛效果以外，對癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡也產(chǎn)生一定影響[2-4]。阿片類中的代表藥物芬太尼，廣泛用于手術患者及癌痛患者的鎮(zhèn)痛。國內(nèi)張咸偉等[5]研究表明，芬太尼抑制MCF-7乳腺癌細胞增殖且具有時間和劑量依賴性。其研究中采用未去除雌激素的新生小牛血清進行實驗。Berthois等[6]研究發(fā)現(xiàn)，酚紅、雌激素都會對MCF-7細胞的增殖產(chǎn)生影響，建議在研究MCF-7細胞的增殖時盡量排除這些因素的干擾。所以本實驗擬在去激素新生小牛血清及無酚紅培養(yǎng)基條件下研究芬太尼對MCF-7乳腺癌細胞增殖、遷移和凋亡的影響。以觀察在不同培養(yǎng)條件下，芬太尼對MCF-7乳腺癌細胞的影響是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 MCF-7乳腺癌細胞由廣西醫(yī)科大學覃怡師姐惠贈。含酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基購自Wisent公司；新生小牛血清購自杭州四季青公司；活性炭購自西隴化工股份有限公司；葡聚糖4萬南購自京都萊生物技術有限公司；MTT粉末及二甲基亞砜購自Sigma公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自invertrogen公司；芬太尼購自宜昌人福藥業(yè)有限責任公司；倒置相差顯微鏡為Olympus公司；酶標儀為美國Thermo公司；流式細胞檢測儀為Beckman Coulter公司。

1.2 細胞的培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)于含10%新生小牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/ml青霉素的含酚紅的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞達80%～90%融合時傳代，以1：2的比例傳代。在進行實驗處理時更換為含10%去激素新生小牛血清的無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基，去激素新生小牛血清的制備參照考朱毅等[7]文獻中的方法獲得。實驗均采用對數(shù)生長期細胞。

1.3 細胞增殖的檢測 將細胞消化離心后，用含10%去激素新生小牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基重懸。按照3×104/ml的密度接種于96孔板，200 μl/孔。設置正常對照組（C組）、芬太尼組（F1組、F2組、F3組、F4組、F5組）和凋零組。24 h后，F(xiàn)1、F2、F3、F4、F5組加入芬太尼，使芬太尼終濃度分別為1、0.1、0.01、0.001、0.0001 μmol/L，C組加入等體積的PBS，凋零組為無細胞只加培養(yǎng)基組，每組設6個復孔。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在24、48、72 h三個時間點，加入MTT（5 mg/ml）20μl，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜200μl，搖床緩慢振蕩10 min，用酶標儀在492 nm波長下測定吸光度值。實驗重復3次。

1.4 細胞遷移的檢測 將細胞用含10%去激素新生小牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基重懸，以2×105/ml的密度接種于6孔板內(nèi)，每孔1 ml，待細胞長至90%滿時，用規(guī)格為200μl的Tip頭對細胞進行劃痕，用PBS輕輕吹打以去除刮掉的細胞，設置C組、F1、F2、F3、F4、F5組，F(xiàn)1、F2、F3、F4、F5組加入芬太尼使芬太尼終濃度分別為1、0.1、0.01、0.001、0.0001 μmol/L，C組為對照組加入等體積PBS，每組設3個復孔，分別于0、24 h進行拍照，采用Image Pro Plus6分析圖像，計算遷移距離。實驗重復3次。

1.5 細胞凋亡的檢測 將細胞用含10%去激素新生小牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基重懸后，按2×105/ml的密度接種于6孔板內(nèi)，每孔1 ml，24 h后，F(xiàn)1、F2、F3、F4、F5組加入芬太尼使芬太尼終濃度分別為1、0.1、0.01、0.001、0.0001 μmol/L，C組加入等體積的PBS，各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用0.25%不含EDTA的胰酶對細胞進行消化，收集細胞，采用Annexin Ⅴ-FITC試劑盒（按照說明書進行）結合流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組3個復孔，實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度芬太尼對MCF-7乳腺癌細胞增殖的影響 作用MCF-7乳腺癌細胞24、48、72 h時，芬太尼組各組OD值與C組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 芬太尼對MCF-7乳腺癌細胞增殖的影響（±s）

表1 芬太尼對MCF-7乳腺癌細胞增殖的影響（±s）

*與C組比較，P>0.05

組別 24 h OD值 48 h OD值 72 h OD值C 組 0.998±0.127 1.259±0.197 1.580±0.193 F1 組 1.023±0.150* 1.111±0.079* 1.294±0.310*F2 組 0.957±0.160* 1.230±0.205* 1.492±0.222*F3 組 1.020±0.052* 1.342±0.248* 1.344±0.351*F4 組 0.994±0.085* 1.190±0.297* 1.415±0.237*F5 組 0.943±0.076* 1.313±0.261* 1.434±0.332*

2.2 不同濃度芬太尼對MCF-7乳腺癌細胞遷移的影響 作用MCF-7乳腺癌細胞24 h時，C組、F1組、F2組、F3組、F4 組、F5 組遷移距離分別為：（191.95±43.05）μm，（212.96±116.83）μm，（260.43±112.90）μm，（239.54±43.33）μm，（231.10±45.62）μm，（234.81±61.59）μm。芬太尼組各組細胞遷移距離與C組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。細胞劃痕結果如圖1所示。

2.3 不同濃度芬太尼對MCF-7乳腺癌細胞凋亡的影響作用MCF-7乳腺癌細胞24 h時，C組、F1組、F2組、F3組、F4組、F5組凋亡率分別為：（31.84±12.85）%，（22.53±8.75）%，（34.02±11.23）%，（26.72±14.18）%，（28.87±5.40）%，（33.23±17.11）%，芬太尼組各組凋亡率與C組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

乳腺癌為女性常見惡性腫瘤，與女性健康密切相關。乳腺癌細胞的增殖、遷移和凋亡與乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移密切相關，因此一直是研究的熱點。石利濤等[8]從治療藥物的角度，研究發(fā)現(xiàn)干擾素-γ、干擾素-α2b的聯(lián)合應用可誘導MCF-7乳腺癌細胞凋亡。本實驗擬從癌痛鎮(zhèn)痛的角度，研究常用鎮(zhèn)痛藥物芬太尼對雌激素受體陽性的MCF-7乳腺癌細胞增殖、遷移和凋亡的影響，為臨床研究奠定基礎。

圖1 芬太尼對MCF-7乳腺癌細胞遷移的影響 （劃痕實驗，×40倍）

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在含去激素新生小牛血清的無酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，芬太尼對MCF-7乳腺癌細胞增殖、遷移和凋亡無明顯影響。張咸偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼濃度大于0.1 μmol/L時，MCF-7乳腺癌細胞增殖活性明顯下降。趙海燕等[9]研究認為，芬太尼抑制MCF-7乳腺癌細胞侵襲。丁漢琳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼大于5 μmol/L時，MCF-7凋亡細胞明顯增加。本實驗與以上研究結論產(chǎn)生差別的主要原因考慮為培養(yǎng)條件不一致導致的。本實驗采用的是去激素新生小牛血清和無酚紅培養(yǎng)基，張咸偉、趙海燕等采用的是未去除激素的新生小牛血清。Berthois等[6]研究發(fā)現(xiàn)，酚紅、雌激素會對雌激素受體陽性的MCF-7細胞的增殖產(chǎn)生影響，建議在研究MCF-7細胞的增殖時盡量排除這些因素的干擾。因此本實驗采用去激素新生小牛血清和無酚紅培養(yǎng)基，擬盡量減少干擾因素的影響，研究芬太尼對MCF-7細胞的直接作用。Maneckjee等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在含激素新生小牛血清中，嗎啡具有抑制MCF-7細胞增殖的作用，但在去除了新生小牛血清中的激素后，嗎啡并不表現(xiàn)出抑制MCF-7乳腺癌細胞增殖的作用。并進一步發(fā)現(xiàn)添加17β-雌二醇可以增加嗎啡對MCF-7細胞的增殖抑制效應。但是雌激素通過何種途徑影響MCF-7乳腺癌細胞對嗎啡的敏感性的機制待于進一步研究[11]。張咸偉、丁漢琳等進一步研究發(fā)現(xiàn)，μ受體拮抗劑納洛酮并不能拮抗芬太尼對MCF-7細胞的抑制增殖作用和促凋亡作用[5，10]。

因此，根據(jù)本實驗結果與張咸偉等實驗結果的比較，推測芬太尼可能不是直接作用于MCF-7乳腺癌細胞產(chǎn)生抑制效應，而是有可能通過影響培養(yǎng)基中雌激素類物質(zhì)與MCF-7乳腺癌細胞表面雌激素受體的作用而產(chǎn)生抑制效應，也有可能是雌激素影響MCF-7乳腺癌細胞對芬太尼的敏感性，這些推測有待于進一步的實驗研究證實。

[1]Friesen C， Bacher S， Hormann I，et al. Cytotoxic effects of opioids on cancer cell lines[J].Int J Clin Pharmacol Ther， 2011，49（1）：60-62.

[2]Lazarczyk M，Matyja E，Lipkowski A W.A comparative study of morphine stimulation and biphalin inhibition of human glioblastoma T98G cell proliferation in vitro[J].Peptides，2010 ，31（8）：1606-1612.

[3]Gach K，Szemraj J， Wyrebska A.The influence of opioids on matrix metalloproteinase-2 and -9 secretion and mRNA levels in MCF-7 breast cancer cell line[J].Mol Biol Rep，2011，38（2）：1231-1236.

[4]HatsukariI，Hitosugi N，Ohno R，et al.Induction of apoptosis by morphine in human tumor cell lines in vitro[J].Anticancer Res，2007，27（2）：857-864.

[5]張咸偉，丁漢琳，張傳漢，等.芬太尼對MCF-7細胞增殖和細胞周期影響研究[J].中國醫(yī)師雜志，2005，7（1）：23-25.

[6]Berthois Y， Katzenellenbogen J A， Katzenellenbogen B S.Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen： implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture[J].Proc Natl Acad Sci USA，1986，83（8）：2496-2500.

[7]朱毅，舒為群，田懷軍.影響 MCF-7細胞增殖試驗相關因素的初步研究[J].第三軍醫(yī)大學學報，2003，25（11）：977-979.

[8]石利濤，楊宗偉，孫立新，等.干擾素-γ、干擾素-α2b聯(lián)合應用誘導MCF-7乳腺癌細胞凋亡及機制[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2010，7（17）：1-2.

[9]趙海燕，張宏波，張海生，等.枸櫞酸芬太尼對乳腺癌細胞體外增殖和侵襲的影響[J].中國婦幼保健，2012，27（1）：112-114.

[10]丁漢琳，張咸偉，張傳漢.芬太尼影響MCF-7細胞凋亡的實驗研究[J].實用醫(yī)學雜志，2004，20（12）：1351-1353.

[11]Maneckjee R， Biswas R， Vonderhaar B K.Binding of opioids to human MCF-7 breast vancer cells and their effects on growth[J].Cancer Res，1990，50（8）：2234-2238.