谷大偉， 馬 莉

(貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室，貴州貴陽550004)

白血病是造血干/祖細胞于分化過程的不同階段發(fā)生分化阻滯、凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。白血病在世界范圍內的日漸高發(fā)且趨于低齡化也引起學者們的廣泛關注，大量研究表明白血病的發(fā)生與癌基因的激活、抑癌基因的失活及細胞凋亡受抑有關［2］。生存素(survivin)又名存活素，是凋亡抑制蛋白家族中迄今為止最強的凋亡抑制因子［3］。survivin大量表達于胚胎及嬰幼兒組織中，正常組織中只有少量表達，而在60余種腫瘤細胞株和大部分人體腫瘤組織中過度表達［4-7］，也包括白血病細胞系［8］。白細胞分化抗原34(CD34)是造血干細胞或(和)祖細胞的特異性標志，正常人骨髓中只有少量CD34+細胞，約占單個核細胞的1.0%～4.0%［9］，在急性髓系白血病(AML)細胞上則有較高頻率的表達。多數學者認為AML中CD34的表達與AML的低緩解率及短生存期有關，僅少數學者認為CD34+AML與CD34－AML病例的緩解率、無病生存期無差異［10］。而關于AML患者骨髓細胞survivin基因與CD34共表達的研究鮮見報道。我們利用流式細胞術檢測骨髓細胞中survivin和CD34的表達，探討二者對白血病發(fā)生、發(fā)展的影響，從而為白血病的診療提供新思路、新方法。

材料和方法

一、對象

1.AML組 選取2010年4月至2011年1月貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液科收治的AML患者共62例，所有病例經臨床及實驗室檢查確診，符合世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標準及英美法協(xié)作組(FAB)診斷標準［1］。其中男28例、女34例，年齡19～60歲。62例AML患者根據治療后是否緩解分組。(1)治療未緩解組:38例，確診后經過2～4個月的臨床治療未達到目前公認的完全或部分緩解標準［1］;(2)治療緩解組:24例，確診后經過2～4個月的臨床治療達到目前公認的完全或部分緩解標準［1］。

2.對照組 2010年4月至2011年1月貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液科收治的非惡性血液病患者31例(包括缺鐵性貧血13例、特發(fā)性血小板減少性紫癜3例、傳染性單核細胞增多癥5例、骨髓未見明顯異常10例)，其中男13例、女18例，年齡23～59歲。所有病例經臨床及實驗室檢查確診，且采集標本時未接受任何臨床治療。

二、方法

1.標本采集 髂前或髂后上棘部位進行穿刺抽取骨髓液1 mL，立即置于含有2 mL肝素抗凝劑的生化管中，輕輕上下顛倒搖勻，避免骨髓液凝固，立即送檢。

2.儀器與試劑 儀器為FACS-Calibur流式細胞儀(美國BD公司)。白血病免疫分型試劑［CD45-Percp、CD10-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD19-藻紅蛋白(PE)、CD20-FITC、CD5-PE、CD2-FITC、CD22-PE、CD7-FITC、CD33-PE、CD15-FITC、CD11b-PE、CD34-FITC、CD14-PE、HLA-DR-FITC、CD13-PE、IgG1-FITC/IgG2a-PE;survivin檢測抗體Survivin-Alexa Fluor488］由美國BD公司和美國Cell Signaling公司提供的。

3.流式細胞術檢測 取100μL骨髓標本，分別加入各熒光標記抗體20μL，充分混勻后室溫(15～22℃)避光孵育20 min;再加入10×紅細胞裂解液1 mL，混勻后室溫(15～22℃)避光8 min，再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL，1 000×g離心5 min，棄上清，重復1次;棄上清，加入適量PBS充分混勻，進行流式細胞儀檢測。運行FACSComp軟件，以BD三色流式細胞儀定標試劑定標，調節(jié)電壓及補償于最佳狀態(tài)，使用CELLQuest軟件進行免疫分型及 survivin檢測分析。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、方差分析和組間多重比較，實驗結果以±s表示，檢驗水準α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。表中各組數據多重比較前均進行了單樣本的K-S檢驗和獨立樣本的t檢驗，確定各組數據均呈正態(tài)分布且具方差齊性(P＜0.01)。

結 果

一、各組survivin+/CD34+雙表達分析

AML治療未緩解組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達均明顯高于AML治療緩解組和非惡性血液病組(P＜0.01、P＜0.05)，而非惡性血液病組和AML治療緩解組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1、圖1。

表1 各組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達比較(±s)

表1 各組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達比較(±s)

注:與AML 治療未緩解組比較，*P＜0.05、＊＊P＜0.01

AML 治療緩解組 24 4.06±1.41# 14.32±7.53*

圖1 各實驗組survivin及CD34+表達情況

二、AML治療未緩解組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達的分析

AML各亞型間存在抗體表達的差異，特別是AML-M3型白血病特征性的不表達CD34。本研究將這一特點結合survivin的表達及分析數據將AML治療未緩解組進一步分為survivin+/CD34+雙表達較高的A組(22例)、有survivin+/CD34+雙表達也有survivin+/CD34－表達的B組以及 survivin+/CD34－表達較高的C組，見圖2～4，比較3組間survivin+/CD34表達的差異。C組survivin+/CD34+雙表達明顯低于A組和B組(P＜0.01、P＜0.05)，而 A 組與B組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。A組survivin+/CD34－表達明顯低于B組和C組(P＜0.01)，而 B組和C組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

圖2 survivin+/CD34+雙表達較高的A組

圖3 survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達的B組

圖4 survivin+/CD34－表達的C組

表2 AML治療未緩解組3亞組間survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達的比較(±s)

表2 AML治療未緩解組3亞組間survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達的比較(±s)

注:與A 組比較，*P＜0.01，與B 組比較，#P＜0.05

組 54.38±16.88 C 組 8 2.93±3.55*# 57.53±25.10*

討 論

survivin屬于凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosis，IAP)家族，具有抑制細胞凋亡、調控細胞周期的作用，廣泛表達于人體的各種腫瘤組織中，通過直接或間接抑制caspase通路而發(fā)揮抗凋亡的作用。王會等［11］的研究提出survivin的治療可以有效地殺死腫瘤細胞，并且最大限度地減少對正常細胞的毒性作用，有望成為一種廣譜的腫瘤診斷標記物，并可能是抗腫瘤治療的重要標靶。林鳳如等［12］應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RTPCR)檢測survivin在急性白血病骨髓細胞中的表達，結果提示survivin表達陽性者明顯高于對照組，獲得完全緩解率明顯低于survivin陰性組，且預后較差。Mori等［13］在對survivin在白血病中表達的研究中發(fā)現，在31例AML及16例急性淋巴細胞白血病中，分別有17例及11例陽性表達survivin，其中M3型AML survivin表達水平最低;在慢性髓系白血病的慢性期沒有檢測到survivin的表達，而在7例急變期的病例中檢測到survivin的表達;二甲亞砜、全反式維甲酸、腫瘤壞死因子可下調HL-60細胞的survivin表達水平，故認為survivin與造血細胞的分化及白血病的發(fā)生有關。王曄［14］的研究表明survivin和bcl-2協(xié)同作用，促進白血病的發(fā)生、發(fā)展。張嵐等［15］通過構建含有人survivin基因的表達質粒并轉染K562細胞的研究方法，結果發(fā)現急性白血病患者survivin mRNA的表達陽性率高于正常對照組，且其表達量在初發(fā)、復發(fā)及緩解時都較正常對照高。這些研究都提示survivin表達紊亂可能在急性白血病的發(fā)病過程中起重要作用，且有可能成為治療及預后的指標之一。陳璽等［16］應用蛋白印跡法檢測18例白血病患者化療前和10名正常對照組外周血中單個核細胞survivin蛋白的表達，并與患者的臨床特點進行相關性分析，結果發(fā)現survivin基因可選擇性地在白血病細胞中表達，提示survivin表達與白血病的發(fā)生有一定的關系。另外李文琦等［17］的研究也表明在成人(ALL)患者中，survivin的高表達可能造成預后不良。目前國內外關于survivin的研究都是以治療前的白血病患者與健康人進行對照，以此分析評價白血病患者在未經治療的疾病狀態(tài)下其骨髓中survivin基因的表達情況。這樣的對照研究只能反映患者一個狀態(tài)時的狀況，而不能動態(tài)綜合評價這一因素在白血病發(fā)生過程中的作用。本研究通過檢測在監(jiān)測期內未轉化為惡性血液病的患者和AML患者骨髓細胞中survivin的表達，探討survivin在非惡性血液病以及AML骨髓細胞中表達的差異情況。同時將AML組分為治療未緩解組和治療緩解組，比較AML患者在經治療未達緩解標準及經治療達到完全或部分緩解標準時survivin的表達變化情況，以此對survivin在AML發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及對臨床治療預后的影響綜合分析。另外本研究選用的流式細胞術較之目前普遍應用的RTPCR法，不僅可以將骨髓細胞上survivin的表達定性，同時可以將這種表達定量分析，也使研究結果更具有說服力。

本研究顯示，加入了 survivin檢測抗體的AML患者的骨髓流式細胞分析圖中，survivin的表達并不只在異常增生的原始細胞中，所有骨髓細胞中都有survivin的表達，提示白血病發(fā)病時survivin表達的增多可能抑制了骨髓中所有細胞的正常凋亡，且這種異常表達可能不受白血病分型的影響。AML治療未緩解組骨髓中survivin的表達均明顯高于AML治療緩解組和非惡性血液病組，提示survivin在骨髓細胞中的表達對白血病治療效果及預后有可能有預估作用。survivin高表達的AML病例后期經治療緩解率低或不能緩解，這與survivin的細胞選擇性表達的特性一致，表明survivin可能對白血病的發(fā)生、發(fā)展及預后有影響作用，也與張向峰等［18］的研究結果相類似。本研究中非惡性血液病組survivin的表達明顯低于AML治療未緩解組，而與AML治療緩解組無明顯差異。本研究推測survivin表達偏低時可能可以降低其他血液疾病轉化為白血病的風險，提示對survivin的檢測可以作為對非惡性血液病轉化為白血病風險的預估指標。此外，本研究中共收取非惡性血液病患者34例，其中3例survivin表達較高，且實驗期間轉化為骨髓增生異常綜合征(MDS)或白血病。本研究將survivin表達較低的31例非惡性血液病作為對照組，且在半年多研究期間暫未轉化為惡性血液病，是否提示survivin表達的升高有利于細胞逃離生長調控，促進白血病細胞的過度增殖蓄積，從而引發(fā)白血病的發(fā)生還有待今后大樣本量的更加深入的研究。CD34是造血干/祖細胞的特征性標志，近年國外文獻報道部分造血系統(tǒng)惡性腫瘤尤其是急性白血病存在早期分化抗原，如CD34、CD90和CD133的異常表達，作為干/祖細胞標志又是重要黏附分子的CD34與急性白血病的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。因此CD34的檢測可以使白血病療效的觀察更具有針對性。本研究將CD34+在AML各表型間表達情況不盡相同的特點與survivin的表達對AML的影響作用相結合，把AML初發(fā)病例的治療未緩解組按表達情況進一步分組加以分析。結果顯示被檢測的AML病例中所有提示有CD34+表達的病例均伴有survivin的表達，但所有提示有survivin表達的AML病例卻并不都伴有CD34+的表達。在CD34+不表達或表達較低的AML患者中，survivin基因高表達的患者同樣緩解率低或不能緩解。因此可以推斷當骨髓細胞中開始出現異常增生的原始細胞時，survivin的過度表達可能比CD34有更顯著的病變提示價值。不久的將來通過更多更加深入的研究，survivin將可能成為臨床診斷和治療白血病的新的更為理想的標志物和靶點。

［1］張之南，沈 悌.血液病診斷及療效標準［M］.第3版.北京:科學出版社，2007:103-132.

［2］安 立，朱永寶，黃 飛.Survivin基因與早期分化抗原在急性白血病中的表達及其相關性的臨床研究［J］.中國現代藥物應用，2008，2(8):4-7.

［3］Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel antiapoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma［J］.Nat Med，1997，3(8):917-921.

［4］Adida C，Crotty PL，McGrath J，etal.Developmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosis gene survivin in human and mouse differentiation［J］.Am JPathol，1998，152(1):43-49.

［5］魏旭倩，王偉祥，王學鋒，等.外周血CEA mRNA、Survivin mRNA、MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA水平與乳腺癌的關系［J］.檢驗醫(yī)學，2011，26(2):94-99.

［6］徐 鋒，孫 杰，曹文俊，等.肝癌患者外周血清生存素檢測的臨床意義［J］.檢驗醫(yī)學，2005，20(4):353-355.

［7］璩 斌，吳 方，焦?jié)嵢?，?結直腸癌患者外周血生存素檢測的臨床意義［J］.檢驗醫(yī)學，2008，23(6):633-637.

［8］Carter BZ，Milella M，Altieri DC，etal.Cytokineregulated expression of survivin in myeloid leukemia［J］.Blood，2001，97(9):2784-2790.

［9］張建中，呂善根.CD34+造血祖細胞的研究進展［J］.國外醫(yī)學輸血及血液學分冊，1995，18(4):224-227.

［10］張文藝，楊淑蓮，閻金玉，等.急性髓細胞白血病CD7、CD34、CD56、P170的表達對完全緩解率的影響［J］.中華內科雜志，2001，40(6):411-412.

［11］王 會，趙瑞杰，王廣彬，等.凋亡抑制基因Survivin與腫瘤的關系［J］.生物技術通報，2010，26(12):31-36.

［12］林鳳茹，王 穎，王榮琦，等.生存素，Fas，bcl-2和bax在急性髓系白血病病人骨髓細胞中的表達及其臨床意義［J］.中國實驗血液學雜志，2003，11(3):259-262.

［13］Mori A，Wada H，Nishimura Y，etal.Expression of the antiapoptosis gene survivin in human leukemia［J］.Int J Hematol，2002，75(2):161-165.

［14］王 曄.Survivin、bcl-2蛋白在白血病中的表達及相關性的探討［J］.中國醫(yī)藥導報，2008，5(8):19-21.

［15］張 嵐.Survivin在急性白血病中的表達及其真核表達載體轉染K562細胞［D］.山西:山西醫(yī)科大學，2008.

［16］陳 璽，肖延風，劉 雅，等.抗凋亡基因survivin在白血病中的表達及其臨床意義［J］.山西醫(yī)科大學學報，2009，40(2):156-158.

［17］李文琦，李曉林，王光平，等.Livin和Survivin基因在成人急性淋巴細胞白血病中的表達及臨床意義［J］.中國實驗血液學雜志，2011，19(4):921-925.

［18］張向峰，付美洲，許邦禮.Survivin基因在兒童急性白血病中的表達及意義［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2009，30(20):37-38.