張磊霞， 王 俊， 顧雙雙， 肖 維， 李 晶， 吳福安, 2， 郭錫杰, 2

(1.江蘇科技大學 生物與化學工程學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212018)(2.中國農(nóng)業(yè)科學院 蠶業(yè)研究所,江蘇 鎮(zhèn)江 212018)

咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)是一種具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗動脈硬化、抗菌消炎等多種藥理活性的天然酚酸類化合物[1].由于提取咖啡酸苯乙酯的蜂膠等天然原料來源受限,制備工藝繁瑣、成本高,提取法難以規(guī)?；?而化學合成法又存在副反應多,能耗高及污染環(huán)境等問題[2].因此，近年來生物合成法因其反應條件溫和、得率高、成本低、副反應少以及對環(huán)境友好等,成為今后規(guī)模化制備咖啡酸苯乙酯的有效途徑.

以往酶法合成酯類化合物,常選擇有機溶劑作為反應介質(zhì).通過調(diào)控溶劑的極性及生物相容性,不僅能夠改善底物溶解度,還可以改變酶的構(gòu)象進而改變催化的立體選擇性.在酶促合成咖啡酸苯乙酯的文獻報道中,常用異辛烷和叔丁醇等溶劑.如文獻[3]利用脂肪酶Novozym 435在叔丁醇中催化咖啡酸與苯乙醇酯化反應,產(chǎn)物得率達40%.但這些溶劑往往存在易揮發(fā)、毒性大、生物相容性差等缺點,近年來已逐漸被一種新興的環(huán)境友好型介質(zhì)——離子液體所取代.離子液體具有蒸汽壓低、熱穩(wěn)定性高等優(yōu)點,能提高酶的熱穩(wěn)定性,并增強酶的活性[4].文中以離子液體[Emim][Tf2N]為介質(zhì),采用脂肪酶催化咖啡酸與苯乙醇酯化合成咖啡酸苯乙酯,72 h后轉(zhuǎn)化率達98.76%,得率達63.75%[5].因此,在離子液體中酶促合成咖啡酸苯乙酯明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的溶劑介質(zhì).

目前脂肪酶催化咖啡酸與苯乙醇酯化合成咖啡酸苯乙酯的轉(zhuǎn)化率相對較低,原因主要有:反應生成的水嚴重影響脂肪酶的催化活性,若采用咖啡酸的低碳脂肪醇酯代替咖啡酸,所產(chǎn)生的低級脂肪醇易揮發(fā),有助于酶促可逆反應的持續(xù)進行;咖啡酸易氧化,在反應體系中很不穩(wěn)定,而采用咖啡酸低碳脂肪醇酯代替咖啡酸提高了底物的熱穩(wěn)定性,并極大地增大了底物在反應體系中的溶解度[6].

然而,利用咖啡酸的低碳烷基酯與苯乙醇的轉(zhuǎn)酯化合成尚未見報道.因此,文中以咖啡酸甲酯和苯乙醇為底物,篩選合適的脂肪酶和離子液體分別作為催化劑和反應介質(zhì),通過考察酶促反應體系中的反應溫度、底物摩爾比、酶用量等對咖啡酸苯乙酯得率的影響,進而建立離子液體中酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯的新工藝.

1 材料與方法

1.1 材料

1) 原料及主要試劑

咖啡酸甲酯(實驗室自制,純度達98%);咖啡酸苯乙酯(標準品,美國西格瑪公司);甲醇、乙腈均為色譜純,苯乙醇、冰醋酸均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；純凈水購自杭州哇哈哈集團有限公司.

2) 酶制劑

Novozym 435(丹麥諾維信公司)；東京豬胰脂肪酶(東京仁成工業(yè)株式會社)；阿拉丁脂肪酶(阿拉丁化學試劑(上海)有限公司)；工業(yè)級脂肪酶(湖北遠成藥業(yè)有限公司)；Sigma 豬胰脂肪酶(美國西格瑪公司).

3) 離子液體

1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([Bmim][PF6])，1-丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽([Bmim][Tf2N])，1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酸鹽([Bmim][CF3SO3])，N-甲基咪唑硫酸氫鹽([Nmim][HSO4])，三辛基甲基銨雙三氟甲磺酰亞胺鹽([TOMA][Tf2N])及1-己基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽([Hmim][HSO4])均購自上海成捷化學有限公司.

1.2 儀器

高效液相色譜系統(tǒng) (配有平流2PB0540型,北京衛(wèi)星制造商)；全波UV-VIS檢測器PLC-2型 (上海金達生化儀器有限公司)；N-2000色譜工作站(浙大智達自動化工程有限公司);色譜柱HC-C18(美國格雷斯公司);水浴恒溫振蕩器SHZ-88型(金壇市醫(yī)療儀器廠);電子精密天平AR1530型(中國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司).

1.3 離子液體中酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯

稱取咖啡酸甲酯(0.05 mM)、苯乙醇(0.80 mM)放入5 mL反應瓶內(nèi),加入1 mL離子液體,置于90℃恒溫水浴搖床內(nèi)反應72 h.每隔12 h取樣20 μL,稀釋50倍后用HPLC檢測分析,每組重復3次.分別對脂肪酶種類、離子液體種類、反應溫度、苯乙醇與咖啡酸甲酯的摩爾比、酶量及時間等因素進行考察,選出最佳反應條件.

1.4 酶促合成產(chǎn)物的HPLC分析

色譜柱:HC-C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;流動相：乙腈∶水(0.5 %冰醋酸)=50∶50(V/V);流速:1.0 mL/min;檢測波長:325 nm;進樣量20 μL[7].進樣HPLC分析前,樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾.

酶促合成產(chǎn)物咖啡酸苯乙酯的得率

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 離子液體的篩選

離子液體的帶電基團不同引起疏水常數(shù)不同,會影響底物與酶的結(jié)合及酶的活性,結(jié)合文獻[8]，文中從6種離子液體中選出酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯的最佳反應介質(zhì).圖1表明在離子液體中酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯的得率隨反應時間延長,先增加后降低,反應24 h達到峰值,得率最高.6種離子液體中[Bmim][PF6]、[Bmim][Tf2N]、[Bmim][CF3SO3]和[TOMA][Tf2N]是相對較好的反應介質(zhì),咖啡酸苯乙酯的最高得率分別為50.27 %，51.77 %，33.11 %和28.97 %;在[Nmim][HSO4]中咖啡酸苯乙酯的最高得率僅為3.47 %,而[Hmim][HSO4]中幾乎不產(chǎn)生咖啡酸苯乙酯.這是因為[Bmim][Tf2N]、[Bmim][PF6]溶解性較弱,陽離子具有較強的疏水性,能夠防止脂肪酶與水的氫鍵作用,保護酶分子的空間構(gòu)型,從而能最大程度地維持酶的催化活性.因此,在離子液體介質(zhì)中,脂肪酶的活性、穩(wěn)定性、選擇性受介質(zhì)的溶解性、疏水性、氫鍵等[9]影響很大.

圖1 不同離子液體對酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯得率的影響Fig.1 Effect of different ionic liquids on the yield of CAPE by enzymatic transesterification

2.2 脂肪酶的選擇

脂肪酶的催化活性與其來源密切相關(guān),圖2表明5種脂肪酶均可以催化咖啡酸甲酯和苯乙醇轉(zhuǎn)酯化合成目標產(chǎn)物咖啡酸苯乙酯,且不同的脂肪酶具有不同的催化效率.其中,Novozym 435明顯是催化轉(zhuǎn)酯化反應合成產(chǎn)物最高效的酶,其合成產(chǎn)物的得率為62.40 %,阿拉丁脂肪酶為催化效率最低的酶,產(chǎn)物得率僅0.26 %.一般說來,酶在離子液體中的活性與離子液體和酶的種類以及兩者之間的相溶性有關(guān)[10]:1)離子液體層保持了脂肪酶表層微環(huán)境的“必需水”,其陽離子具有較強的疏水作用,能防止酶與水的氫鍵作用而保護其空間構(gòu)型,從而能維持酶的催化活性.2)不同來源的脂肪酶具有不同的催化特點和催化活力,微生物脂肪酶比動物脂肪酶具有更廣的作用溫度范圍、更高的催化活性和熱穩(wěn)定性以及反應選擇性.圖中阿拉丁脂肪酶為牛胰腺脂肪酶,東京豬胰脂肪酶和Sigma豬胰脂肪酶為豬胰脂肪酶,都屬于動物脂肪酶；而 Novozym 435和工業(yè)級脂肪酶均為微生物脂肪酶.3)反應中酶的固定化、化學修飾、表面活性劑涂層等是提高酶活性和穩(wěn)定性的重要反應策略,Novozym 435是一種耐熱型的固定化酶,它能在高溫下仍然發(fā)揮較高的催化活性.4)工業(yè)級脂肪酶的有效作用溫度為15～45 ℃[11],因高溫易破壞其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)致使酶分子發(fā)生不可逆的失活而降低其催化活性.綜上所述,酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙醇的最佳催化劑是Novozym 435.

圖2 90℃下不同脂肪酶對酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯得率的影響Fig.2 Effect of different lipase on the yield of CAPE by enzymatic transesterification at 90℃

2.3 反應溫度

在離子液體中,溫度不僅會影響脂肪酶的催化活性,還會影響到底物在反應介質(zhì)中的溶解度.文中考察了不同反應溫度(其他反應條件均相同)對酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯得率的影響(圖3).由圖可知，在30，45和60 ℃下[Bmim][Tf2N]轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯的得率60 h內(nèi)隨著反應時間的增加而增加,60 ℃時達到最高,為59.34%,這是因為溫度低時酯交換速率低,從而酶促反應轉(zhuǎn)化率低,致使反應時間延長;而在75℃和90℃較高溫度條件下,產(chǎn)物的得率隨反應時間的增加先不斷增加后逐漸降低,均在24 h時最高,其中90℃下反應24 h時的得率最大,達63.95%,由此可見高溫可縮短達到最高得率的反應動態(tài)平衡時間,且提高了產(chǎn)物的得率.另外,在前24 h內(nèi)產(chǎn)物的得率均隨著溫度的升高而升高,超過24 h后低溫(30，45及60℃)下的反應得率隨反應的進行仍不斷升高,而高溫(75，90℃)下的產(chǎn)物得率卻不斷下降,這一方面可能是因為咖啡酸甲酯在反應體系中發(fā)生水解反應生成了甲醇,且由于水解反應是吸熱過程,溫度過高會促進水解反應,從而生成更多的甲醇,甲醇的積累則會使化學平衡向逆反應方向移動,導致轉(zhuǎn)酯化反應的正反應速率下降，產(chǎn)物的得率也隨之下降；另一方面可能是因為高溫時間太久,部分酶失去活性,酶整體的催化活性有所下降[12].因此,綜合考慮溫度對酶以及轉(zhuǎn)酯化反應和產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響,文中選取的最佳反應溫度為90℃.

圖3 溫度對酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of CAPE by enzymatic transesterification

2.4 底物摩爾比

文中考察了不同醇酯摩爾比(5∶1,10∶1,15∶1,20∶1,25∶1及30∶1)對產(chǎn)物得率的影響，結(jié)果見圖4,圖中R為nPE∶nMC(mol/mol).由圖可知,90℃下酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯的最佳醇酯摩爾比為20∶1,得率最高64.01 %，隨著醇酯比的增加,得率逐漸增大,當酯醇比達到20∶1后,再增加醇的量,得率反而降低.這是因為轉(zhuǎn)酯化反應為可逆反應,底物苯乙醇的加入量在一定范圍內(nèi)的增多會使反應的化學平衡向正反應方向移動,然而過多的醇分子可通過其疏水性側(cè)鏈與脂肪酶活性中心周圍的非極性氨基酸相互作用,引起酶構(gòu)象的局部改變,不利于酶與底物的結(jié)合[13].

圖4 醇酯摩爾比對酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯得率的影響Fig.4 Effect of molar ratio of PE to MC on the yield of CAPEby enzymatic transesterification

2.5 酶用量

文中采用前述實驗得出的最佳條件:離子液體[Bmim][Tf2N]、Novozym 435，反應溫度90℃,醇酯摩爾比為20∶1,咖啡酸甲酯0.05 mM.將酶酯的質(zhì)量比分別取為1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1,恒溫振蕩反應24 h,結(jié)果見圖5.當酶酯質(zhì)量比為10∶1時,咖啡酸苯乙酯的得率隨著酶量的增加而增大,其得率達到最高為66.40%;而當脂肪酶用量繼續(xù)增大時,得率反而降低.這是因為Novozym 435是固定化酶,過多的酶會導致固定化酶之間相互占用酶自身的有效位點,使得酶促反應的實際表面積減少,減少了底物與酶的接觸,從而導致產(chǎn)物得率降低[14].因此,酶促轉(zhuǎn)酯化合成反應的最佳酶酯質(zhì)量比為10∶1.

圖5 酶酯質(zhì)量比對酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯得率的影響Fig.5 Effect of mass ratio of Novozym 435 to MC on the yield of CAPE by enzymatic transesterification

2.6 酶促酯化與酶促轉(zhuǎn)酯化的工藝比較

已報道的離子液體中生物合成咖啡酸苯乙酯的方法,只有脂肪酶催化咖啡酸和苯乙醇的酯化法.文中首次建立離子液體中脂肪酶催化咖啡酸甲酯和苯乙醇的轉(zhuǎn)酯化法,與課題組前期對離子液體中咖啡酸和苯乙醇的酶促酯化法的對比見表1.由表1可看出,文中建立的酶促轉(zhuǎn)酯化法與酶促酯化法合成咖啡酸苯乙酯相比,不僅產(chǎn)物的得率得到提高,而且反應時間大幅度縮短,為原來的1/2,顯著提高了酶促合成的效率.

表1 酶促酯化與酶促轉(zhuǎn)酯化反應合成咖啡酸苯乙酯的工藝參數(shù)比較Table 1 Comparative results of the enzymatic synthesis of caffeic acid phenethyl ester by esterification and transesterification reactions

3 結(jié)論

文中建立了離子液體中酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯的新工藝,其最佳工藝條件：離子液體[Bmim][Tf2N]為介質(zhì),Novozym 435為催化劑,反應溫度90℃,醇酯摩爾比20∶1,酶酯質(zhì)量比10∶1,24 h時產(chǎn)物得率達到最高66.40%.與酶促酯化法相比,新工藝不僅提高了產(chǎn)物得率,且大幅度縮短了反應時間,大大提高了酶促合成效率.

參考文獻(Reference)

[1] Teke Z,Bostanci E B,Yenisey C,et al. Caffeic acid phenethyl ester alleviates mesenteric ischemia/reperfusion injury[J].JournalofInvestigativeSurgery,2012,25(6): 354-365.

[2] 王俊,吳福安,陶士強,等.國產(chǎn)槲寄生多糖提取純化工藝的研究[J].江蘇科技大學學報:自然科學版,2008,22(3): 77-82.

Wang Jun,Wu Fuan,Tao Shiqiang,et al.Study on separation and purification technology of polysaccharides fromViscumcoloratum(Kom.) Nakai[J].JournalofJiangsuUniversityofScienceandTechnology:NatureScienceEdition,2008,22(3): 77-82.(in Chinese)

[3] Stevenson D E,Parkar S G,Zhang J,et al.Combinatorial enzymic synthesis for functional testing of phenolic acid esters catalysed byCandidaantarcticalipase B (Novozym 435)[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2007,40(5): 1078-1086.

[4] Wang J,Sun G,Yu L,et al.Enhancement of the selective enzymatic biotransformation of rutin to isoquercitrin using an ionic liquid as a co-solvent[J].BioresourceTechnology,2013,128: 156-163.

[5] Wang J,Li J,Zhang L,et al.Lipase-catalyzed synthesis of caffeic acid phenethyl ester in ionic liquids: Effect of specific ions and reaction parameters[J].ChineseJournalofChemicalEngineering,2013.doi:10.1016/S1004-9541(13)60563-7.

[6] Pang N,Wang F,Cui H,et al.Lipase-catalyzed synthesis of caffeic acid propyl ester in ionic liquid[C]∥AdvancedMaterialsResearch,2013,634-638: 555-558.

[7] Wang J,Gu S,Pang N,et al.A study of esterification of caffeic acid with methanol using p-toluenesulfonic acid as a catalyst[J].JournaloftheSerbianChemicalSociety,2013.doi:10.2298/JSC120802101W.

[8] Findrik Z,Nemeth G,Gubicza L,et al.Evaluation of factors influencing the enantioselective enzymatic esterification of lactic acid in ionic liquid[J].BioprocessandBiosystemsEngineering,2012,35(4): 625-635.

[9] 李晶,王俊,張磊霞,等.離子液體中脂肪酶催化酯類合成的新進展[J].有機化學,2012,32(7): 1186-1194.

Li Jing,Wang Jun,Zhang Leixia,et al.Progress of lipase-catalyzed ester synthesis in ionic liquid[J].JournalofOrganicChemistry,2012,32(7): 1186-1194.(in Chinese)

[10] 李俊奎,魯吉珂,王芳,等.固定化脂肪酶催化毛油合成生物柴油[J].生物工程學報,2009,25(6): 941-945.

Li Junkui,Lu Jike,Wang Fang,et al.Synthesis of biodiesel from crude oil by immobilized lipase[J].ChineseJournalofBiotechnology,2009,25(6): 941-945.(in Chinese)

[11] 季青春,曹艷,任偉,等.假單胞菌脂肪酶手性拆分研究進展[J].化工進展,2010,29(4): 722-727,744.

Ji Qingchun,Cao Yan,Ren Wei,et al.Research progress in Pseudomonas lipase for chiral resolution[J].ChemicalIndustryandEngineeringProgress,2010,29(4): 722-727,744.(in Chinese)

[12] Xin J,Chen L,Zhang Y,et al.Lipase-catalyzed transesterification of ethyl ferulate with triolein in solvent-free medium[J].FoodandBioproductsProcessing,2011,89(4): 457-462.

[13] Raita M,Laothanachareon T,Champreda V,et al.Biocatalytic esterification of palm oil fatty acids for biodiesel production using glycine-based cross-linked protein coated microcrystalline lipase[J].JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic,2011,73(1-4): 74-79.

[14] Herbst D,Peper S,Niemeyer B.Enzyme catalysis in organic solvents: influence of water content,solvent composition and temperature onCandidarugosalipase catalyzed transesterification[J].JournalofBiotechnology,2012,162(4): 398-403.