張志毅 安小平 莊 璐 馬麥卷 米志強 黃 勇 范 航 劉 瑋 童貽剛

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071)

近年來，由于氣候變化和環(huán)境破壞等因素，蟲媒傳染病疫情不時發(fā)生，其控制變得日益復(fù)雜(鄭學(xué)禮，2011)。除了已熟知的蟲媒傳染病，20世紀(jì)70年代以來，多數(shù)年份都有一種或一種以上的新傳染病被發(fā)現(xiàn)，新發(fā)傳染病至今達40余種，而且其病原微生物種類復(fù)雜，有病毒、細菌、(包括立克次體、衣原體、螺旋體)及寄生蟲等(寶福凱等，2009)。蟲媒傳染病病原體的本底調(diào)查，對于蟲媒傳染病防控有重要意義。

傳統(tǒng)的病原體檢測方法費時費力，尤其對于新發(fā)傳染病，早期發(fā)現(xiàn)及診斷更為困難。測序方法是確定微生物種類的重要方法之一(秦楠等，2011)。傳統(tǒng)的Sanger序列測定方法耗時長、成本高、通量低，無法滿足對于未知病原的高通量分析。由于未知病原體的核酸序列未知，也不能夠直接采用PCR 技術(shù)進行擴增和測序(李建彬等，2011)。近幾年來，高通量測序技術(shù)，又稱新一代測序技術(shù)(next-generation sequencing)的出現(xiàn)，使得測序費用相對于Sanger測序方法大幅下降，已廣泛應(yīng)用于動植物全基因組測序、基因組重測序、轉(zhuǎn)錄組測序、小RNAs測序和表觀基因組測序等領(lǐng)域(岳桂東等，2012)，對于整個生命科學(xué)研究都產(chǎn)生巨大的影響，同時也為蟲媒傳染病病原體的快速檢測提供了一條新的有效途徑。

宏基因組(Metagenomics)高通量測序方法篩查病原體是一種新型的有效方法(Nakamuraetal.，2011)，但對于病毒病原而言，由于其基因組相對于原核生物和高等生物的基因組而言非常小，相對含量很低，其序列在測序數(shù)據(jù)分析時很容易被宿主序列所掩蓋。小分子RNA(Small RNA，sRNA)是長度一般為20～30個核苷酸的非編碼RNA 分子，無脊椎動物如蠶、蚊蟲、線蟲等應(yīng)對RNA病毒入侵時可產(chǎn)生與其對應(yīng)的小干擾RNA(siRNA)，昆蟲siRNA免疫機制對入侵的RNA病毒的特定序列進行加工和放大，并利用這些小RNA分子抑制病毒基因的表達，從而達到控制病毒復(fù)制和致病的目的(Wuetal.，2010)。這種免疫機制使昆蟲體內(nèi)小RNA中病毒序列相對的比例更加突出。研究發(fā)現(xiàn)sRNA在真核細胞和原核細胞中對基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮著重要作用，因此動植物體內(nèi)都有數(shù)量巨大的小分子RNA，如何從巨量的sRNA中確定病原體RNA或病原體相關(guān)sRNA，是一個值得探討的科學(xué)問題，然而傳統(tǒng)測序法操作復(fù)雜，花費大，測序深度有限，效率較低，難以解決這一問題，新一代高通量測序技術(shù)具有速度快、成本低、覆蓋度深、產(chǎn)出巨大等優(yōu)點，非常適合小分子RNA 測序(衛(wèi)波等，2009)。已有研究報道小分子RNA高通量測序可以用來發(fā)現(xiàn)媒介昆蟲攜帶病毒的報道(Janetal.，2009; Shietal.，2009；陳斌等，2011)。對于其他病原體，還未見相關(guān)報道。目前，具有傳播媒介能力的節(jié)肢動物中以蚊類最多。已登記的535種蟲媒病毒中，從蚊類分離到的病毒占近50%，其次是從蜱分離到的病原體(116種)，占蟲媒病毒總數(shù)的21.68%(李文剛等，2011)。因此本文選取蚊和蜱為例，嘗試了基于小分子RNA高通量測序篩查媒介昆蟲攜帶病原體的方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小RNA病原體篩查范圍其實不僅限于RNA病毒和DNA病毒，還可以發(fā)現(xiàn)原核以及真核生物病原體?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蚊蟲從云南西雙版納地區(qū)野外捕獲，分別為3個種類：中華按蚊Anophelessinensis、三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus和致倦庫蚊Cx.quinquefasciatus，各100只左右。蜱采自黑龍江牡丹江市林區(qū)，包括全溝硬蜱Ixodespersulcatus18只、邊緣革蜱Dermacentormarginatus19只和長角血蜱Haemaphysalislongicornis21只。

1.2 總RNA 的提取

液氮冷凍，同種的所有蟲體取出研磨后各以500 μL 的Trizol (購自Invitrogen) 裂解，加入蛋白酶以65℃處理30 min后提取總RNA。具體步驟：在室溫15～30℃放置5 min，加入氯仿，用力震蕩約15 s，室溫下放置2～3 min， 12 000 r/min(4℃) 離心15 min；取上層水相加入異丙醇，在室溫下放置10 min， 12 000 r/min(2℃～8℃) 離心10 min；棄上清，加75%乙醇洗滌，渦旋混合，7 500 r/min(2～8℃) 離心5 min，棄上清; 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥5～10 min，用DEPC 水溶解。RNA 沉淀，55～60℃孵育10 min。

1.3 樣品的制備與Solexa 測序

siRNA 分離與高通量測序由深圳華大基因公司完成，具體流程如下：首先用聚丙烯酰胺電泳分離siRNA，切膠回收18～30 nt 大小的片段，兩端分別連接RNA 接頭，然后進行反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴增，最后將擴增產(chǎn)物上樣進行Solexa 法測序。

1.4 數(shù)據(jù)過濾

初始數(shù)據(jù)采用軟件Solexa pipeline進行以下幾步過濾：1)去掉低質(zhì)量的reads；2)去掉5′接頭和3′接頭序列；3)過濾無插入接頭序列；4)過濾ployA reads。

1.5 判別方法

1.5.1序列比對。使用NCBI的Blast(2.22)軟件中的blastn作核酸比對，下載NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(nt庫2013年4月)建立本地化核酸數(shù)據(jù)庫，以過濾后的測序reads作為查詢項，進行全面比對搜索。只給出得分在前10位的結(jié)果。

1.5.2blast結(jié)果過濾。通過以下幾步對結(jié)果進行過濾：每個結(jié)果只保留得分最高的，如果有并列最高的兩項屬于不同物種則認為屬于不同物種間保守序列而予以忽略；去掉核糖體RNA(因為核糖體RNA有較高保守性且數(shù)量較多，因此特異性差)；去掉匹配長度小于21 bp的結(jié)果(因為reads序列較短，匹配短的很可能是隨機匹配)。

1.5.3物種分析。因為NCBI只給出了gi號與種屬分類編號的對應(yīng)文件，從nt庫的標(biāo)題可以得到gi號與具體數(shù)據(jù)庫編號(如ref、emb、dbj等)的對應(yīng)關(guān)系。而blast結(jié)果只給出具體數(shù)據(jù)庫編號，所以由具體數(shù)據(jù)庫編號得到對應(yīng)gi號，再得到種屬分類編號，進行統(tǒng)計得到與各屬匹配的reads數(shù)和匹配總長度，最后轉(zhuǎn)化為屬的名稱。全部過程用自行編寫的python程序完成。

1.5.4校正排序。因為小RNA序列較短，比對搜索的結(jié)果中必然有較多的非特異的隨機匹配?？紤]到nt庫中搜集的某一種屬的序列越多，被隨機匹配到的可能性越大，因此我們又將最后得到每個種屬的匹配總長度除以該種屬在nt庫中的總長度，得到檢出比值，按照這個比值從大到小排序。這個比值越大的，表明該種屬有更大的檢出可能性。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序統(tǒng)計結(jié)果

6只樣品分別經(jīng)過RNA提取，小RNA分離、純化和測序，并經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，得到有效小RNA序列的數(shù)量和測序的平均覆蓋倍數(shù)估計值在表1中列出。

表1 各蟲種測序reads數(shù)和平均覆蓋倍數(shù)Tab.1 Number of reads and coverage of the 6 vector insects

2.2 Blast及結(jié)果過濾

將各樣品的有效reads作為查詢項，輸入到nt庫做Blast比對搜索。只保留得分在前10的結(jié)果。然后將每一條比對結(jié)果中得分最高的一項匯集起來進行統(tǒng)計。因為每株昆蟲樣品中，核糖體RNA的數(shù)量都占有較高比例，所以首先將結(jié)果中的核糖體RNA的條目去掉。這一步可去除11%～18%的匹配項。

小RNA長度較短，從表1可以看出，22 nt長的reads占了大多數(shù)。而nt庫含有1 600多萬條序列，總堿基長度達到37 594 899 229 nt，有許多研究詳盡的物種如人、鼠、果蠅等物種的序列，基因組很大且收錄得有冗余，因此搜索時，當(dāng)長度小于等于20時，得到隨機匹配的幾率非常大。我們曾做過測試，設(shè)計了10 000條22 bp的隨機序列，去和nt庫比對，發(fā)現(xiàn)匹配在18～20 bp的條目占了接近60%的比例。因此，選取Blast結(jié)果中匹配堿基數(shù)大于20的條目能夠進一步去除非特異隨機匹配，使其不至于干擾真實結(jié)果。結(jié)果表明，可進一步去掉約2/3的條目。

2.3 病原體篩查結(jié)果

對剩下的Blast結(jié)果進行統(tǒng)計，首先根據(jù)每一條的數(shù)據(jù)庫編號找到對應(yīng)的GenBank序號(gi號)，并記下其匹配堿基數(shù)，這一步完成后，將gi號相同的條目的匹配堿基數(shù)相加，得到每個gi號對應(yīng)匹配總長度之和。而后將gi號變?yōu)閷?yīng)的物種分類編號，就得到所包含的每個物種的匹配總長度。結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，由于人、小鼠等物種在nt庫中總長度很大，所以其隨機匹配幾率很高，在結(jié)果中排名很靠前。為了排除這類非隨機匹配的干擾，用每個種屬的匹配長度除以該種屬在nt庫中的總長度的比值大小來排序，就可以使檢出比超出背景值的物種排在前面。

在結(jié)果中，排在最前面的是所測昆蟲的物種及其近緣物種，其數(shù)量占有絕對優(yōu)勢。此外一些環(huán)境微生物、植物、真菌也占有相當(dāng)比例。除去此類一般意義的物種外，一些重要的病原體是我們最關(guān)注的。

根據(jù)以上算法，我們得到的初步結(jié)果中(表2)，中華按蚊可能攜帶有乙型腦炎病毒。乙型腦炎又稱“日本腦炎”，主要通過蚊蟲叮咬傳播，庫蚊、伊蚊、按蚊中均有一些種可以傳播此病，主要流行區(qū)域為東南亞、西太平洋地區(qū)，我國除新疆、西藏、青海外均為乙腦疫區(qū)(郭楊等，2008)。三帶喙庫蚊則可能攜帶的病原體是庫蚊濃核病毒(Brevidensovirus)。蚊濃核病毒屬于細小病毒科，特異性感染蚊類，引發(fā)特異性的細胞核致密增生病變并可最終導(dǎo)致宿主發(fā)病或死亡(顧金保等，2008)。根據(jù)顧金保的統(tǒng)計，2007年以前發(fā)現(xiàn)的蚊濃核病毒，有兩株是在中國發(fā)現(xiàn)的，分別是淡色庫蚊濃核病毒(Culexpipienspallensdensovirus, CpDNV)和C6/36濃核病毒(C6/36 DNV)。我們樣品中的病毒應(yīng)該更接近于前者。庫蚊黃病毒為只感染蚊蟲的黃病毒(Kimetal.，2009)，有研究報道該病毒可與黃病毒屬的其他病毒共同感染三帶喙庫蚊(Kentetal.，2010)，但是否相互影響還有待研究。致倦庫蚊中發(fā)現(xiàn)的可能病原體則是果蠅X病毒，該病毒由兩條核酸鏈組成，A鏈序列于1996年測定(Chungetal.，1996)，B鏈于2002年測定(Shwedetal.，2002)，但該病毒在研究昆蟲的病毒免疫機制中應(yīng)用較多，對人的致病性還待深入研究。全溝硬蜱最可能攜帶的病原體有：peacockii立克次體(Rickettsiapeacockii，Rp)。邊緣革蜱最可能攜帶的病原體有：立氏立克次體(Rickettsiarickettsii，Rr)。長角血蜱最可能攜帶的病原體是：伯氏柯克斯體Coxiellaburnetii。R.peacockii和R.rickettsii都屬于斑點熱群立克次體，目前NCBI物種分類數(shù)據(jù)庫收錄的斑點熱群立克次體不少于幾十種。2005的一項調(diào)查研究，總結(jié)了我國之前引起立克次體病的10種病原體(張麗娟等，2005)，其中只有伯氏柯克斯體出現(xiàn)血蜱中，R.peacockii和R.rickettsii在國內(nèi)較少有報道。伯氏柯克斯體習(xí)慣上稱為Q熱立克次體，它所引起的Q熱是一種人獸共患病。

表2 蜱與蚊蟲中可能含有的病原體Tab.2 Possible pathogens contained in ticks and mosquitos

3 討論

常規(guī)病原體高通量檢測需要對不同的病原體采用不同的純化方案和測序方案，如細菌和原蟲作為細胞生物，需要按照細胞生物的分離方法將它們與人體血液和組織成分分離，并提取DNA進行測序；而DNA病毒及支原體、衣原體需要按照可濾過性病原體進行分離和DNA樣品提??；RNA病毒則需要采用濾過性提取方法提取和進行RNA測序。對于未知病原體，上述3種方案需要分別考慮，選擇使用，最可靠的辦法是同時采用上述3種方案進行高通量測序分析，這些操作在時間、人力和經(jīng)濟上都會造成很大負擔(dān)。如果采用RNA高通量測序技術(shù)，則可以用一種測序方案檢測所有類型的病原體，這不僅能夠節(jié)省很多的人工和試劑費用，更重要的是可以節(jié)省大量時間，尤其是在有暴發(fā)疫情的時候，病原體篩查的速度將顯得十分關(guān)鍵。小RNA高通量測序篩選媒介昆蟲攜帶病毒已經(jīng)被證明是一種有效的策略(Jan，2009; Wuetal.，2010)。本研究結(jié)果表明，用這一方法也不僅可以檢測媒介昆蟲攜帶的病毒，而且對細菌及原蟲等病原體的檢測也具有很大的潛力。因此用小RNA高通量測序篩查病原體，只需一次測序，一次分析就得到樣品可能含有的病毒、原核及真核的各類病原體，具有快速、簡便、節(jié)省費用的突出優(yōu)點。

小RNA由于其在調(diào)控、免疫等方面的重要作用，當(dāng)前受到格外關(guān)注，各類研究已積累了大量的小RNA高通量測序數(shù)據(jù)。因此用本文所述的方法對這些小RNA數(shù)據(jù)進行分析，可獲得樣品中可能含有的各類物種的信息，這對于充分利用實驗數(shù)據(jù)獲取有用信息具有一定意義，也可能對疾病的發(fā)生機制、發(fā)展進程與預(yù)后提供一些新的線索。

通過上述的生物信息學(xué)分析，大大縮小了后期實驗驗證的范圍。但由于小分子RNA核苷酸序列長度較短，因此在對大的核酸數(shù)據(jù)庫比對搜索時，非特異性的隨機匹配可能性較大，因此有必要進一步優(yōu)化生物信息學(xué)分析參數(shù)來盡可能排除掉比對結(jié)果中的各種非特異匹配，并需進一步做實驗驗證。