王 旺 王 靜 孫肖紅 楊 宇 張曉龍 趙婷婷 曹曉梅

(中國檢驗檢疫科學研究院衛(wèi)生檢疫研究所, 北京 100123)

蚊媒病毒是一類重要的傳染病病原體，包括多種病毒，其中很多造成過世界范圍內(nèi)的傳染病大流行(詹希美, 2001)。近年來，隨著全球氣候逐漸上升、城市化進程的加快、旅游和貿(mào)易的快速發(fā)展、生態(tài)環(huán)境的不斷變化，全球蚊媒傳染病發(fā)病呈上升趨勢，原有疾病的流行區(qū)域不斷擴展、疾病的流行頻度不斷增加，有日益蔓延的趨勢(Slenning, 2010)。因此開發(fā)針對蚊媒病毒特異、敏感且快速的檢測方法對相應疾病的的預防、治療以及流行的有效控制均具有重要意義。懸浮芯片(Suspension array)也稱液相芯片(Liquid array, Liquid chip)，是一種非常靈活的多功能技術(shù)平臺，可以進行蛋白、核酸等生物大分子檢測、受體和配體識別分析等研究。懸浮芯片主要通過可偶聯(lián)探針的熒光編碼微球與兩束激光檢測，對被測物的定性和定量分析，一個反應孔內(nèi)可以完成100種不同的生物學反應，從而實現(xiàn)對核酸的多重檢測(Dunbar, 2006)。本研究利用懸浮芯片系統(tǒng)為平臺，針對十二種重要的蚊媒病毒，建立了一種能檢測蚊子所攜帶的一種或多種病毒的迅速、準確而可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株及樣品: 分別包含東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus，EEEV)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus，WEEV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV)、基孔肯亞病毒(Chikungunya virus，CHIK)、登革病毒(Dengue virus，DEN)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、黃熱病毒(Yellow fever virus，YF)、西尼羅病毒(West Nile virus，WN)、圣路易斯腦炎病毒(St. louis encephalitis virus，SLEV)、版納病毒(Banna virus，BAV)、布尼亞病毒(Bunyavirus，BUN)、裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus，RVF)12種病毒檢測靶標基因的菌株，由北京華大基因公司合成基因片段后，轉(zhuǎn)化至JM109菌株?，F(xiàn)場樣品來自2009年在中國云南邊境地區(qū)的人房和畜圈采集的蚊蟲標本。陰性蚊蟲標本由遼寧出入境檢驗檢疫局醫(yī)學媒介中心提供。

1.1.2主要試劑及儀器：酶及緩沖液(TaKaRa，大連)；DNA-marker(Takara，大連)；膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒(QIAGEN，Germany)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PROMEGA，USA)；MicroPlex-TAG Beads(Luminex，USA)；藻紅蛋白標記的鏈霉親和素 (Streptavidin-R-phycoerythrin, SA-PE) Invitrogen公司SA-PE(Invitrogen，USA)；96孔酶標板(Nunc，USA)；Bioplex 100液相芯片檢測系統(tǒng)(Bio-rad，USA)。

1.1.3引物設計與合成：通過DNAstar軟件分別對每個屬的基因進行序列比對和保守序列分析。用PrimerPlex軟件設計特異性引物。每條上游引物5′端添加特異的 anti-TAG 序列(與Luminex公司提供x-TAG 磁性微球上的 TAG 序列反向互補)，引物與TAG之間連接C9作為加臂，下游引物5′端用生物素修飾。PCR引物均由生工生物工程(上海) 有限公司合成(表1)。

表1 所用的12種蚊媒病毒的擴增引物Tab.1 Designed primers of the 12 species mosquito-borne virus for multi-PCR

注：EEEV: 東方馬腦炎病毒 Eastern equine encephalitis virus; WEEV: 西方馬腦炎病毒W(wǎng)estern equine encephalitis virus; VEEV: 委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒 Venezuelan equine encephalitis virus; CHIK: 基孔肯亞病毒 Chikungunya virus; DEN: 登革病毒Dengue virus; JEV: 日本腦炎病毒 Japanese encephalitis virus; YF: 黃熱病毒Yellow fever virus; WN: 西尼羅病毒 West nile virus; SLEV: 圣路易斯腦炎病毒 St. louis encephalitis virus; BAV: 版納病毒 Banna virus; BUN: 布尼亞病毒 Bunyavirus; RVF: 裂谷熱病毒 Rift valley fever virus。下同。The same below.

*斜體為anti-TAG 序列(與x-TAG磁性微球上的TAG序列反向互補)。Italics represents anti-TAG sequences(reverse complementary sequence of the TAG on the x-TAG magnetic microspheres).

1.2 方法

1.2.1菌株質(zhì)粒提取: 將帶有陽性克隆的工程菌用質(zhì)粒微量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，操作方法按說明書進行，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測提取質(zhì)粒。通過超微量紫外分光光度計測得各質(zhì)粒濃度，并將其稀釋到10 ng/μL備用。

1.2.2引物特異性驗證: 將合成好的引物按說明溶解后，分別按如下配置PCR反應體系，12對引物對應的12種不同反應體系中對應加入已提取并稀釋的DNA模板。PCR體系：10 × PCR buffer 3 μL；Taq HS 0.3 μL；dNTPs 4 μL；上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；DNA 2 μL；雙蒸水補足30 μL。反應條件是：94℃預變性10 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

PCR陰性對照：除不加模板而以雙蒸水代替外，其余體系相同。反應結(jié)束后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增情況。

1.2.3多重PCR體系及條件優(yōu)化: 將12種待檢病毒按種屬分為3組，第1組為東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、基孔肯亞病毒；第2組為黃熱病毒、西尼羅腦炎病毒、登革病毒、乙型腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒；第3組為版納病毒、布尼亞病毒、裂谷熱病毒。并結(jié)合后續(xù)實驗結(jié)果，對多重PCR的退火溫度以及體系中加入引物量進行優(yōu)化。

1.2.4雜交及雜交條件的優(yōu)化: 取每種帶有anti-TAG標簽的微球各3 500個加入到雜交液中，使其總量為35 μL；向各管中加10 μL蚊媒病毒的PCR產(chǎn)物吹打混勻；向各孔加4 ng/μL SA-PE的1×TMAC液(全稱)，使之總體積變?yōu)?0 μL，37℃下雜交一定時間；轉(zhuǎn)移至磁力板上洗掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物再向各孔加入80 μL 1× TE溶液，振蕩使微球重懸；用Bio-Plex 100 system進行檢測，對結(jié)合的PCR產(chǎn)物進行分析。雜交條件的優(yōu)化：分別對雜交溫度、雜交時間和PCR產(chǎn)物加入量進行優(yōu)化。雜交溫度分別選擇35℃、37℃、40℃、42℃、45℃ 5個溫度進行，其他步驟照上述進行，保持不變，以MFI進行結(jié)果判斷。確定雜交溫度后，雜交時間分別取15、20、25、30 min，進行雜交時間的優(yōu)化。

1.2.5檢測體系特異性實驗: 體系內(nèi)特異性：將十二種病毒中每一種模板分別用其他11種檢測引物擴增并雜交，上機檢測MFI(mean fluorescence intensity)值，考核系統(tǒng)內(nèi)對樣品檢測的特異性。

體系外特異性：選取了墨累谷腦炎、瘧原蟲、森林腦炎病毒、流行性出血熱病毒作為對照，驗證本檢測方法的特異性。

1.2.6檢測體系靈敏度實驗: 待檢目標核酸系列稀釋，設10個稀釋度，最優(yōu)條件下進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，用Bio-Plex Version 4.0分析系統(tǒng)得到檢測體系的方程擬合標準曲線，同時得出檢測體系的檢測下限。

1.2.7實際樣品檢測試驗:從液氮中取出凍存蚊蟲標本，研磨后取上清140 μL用試劑盒提取RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA用本方法進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 退火溫度優(yōu)化

按基本PCR體系，退火溫度選擇52℃、54℃、56℃、58℃、60℃，分別對3組待檢病毒進行擴增，并同時設置PCR陰性對照，擴增結(jié)果用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查，結(jié)果證明56℃時3組中大部分病毒檢測的MFI值均高于其他溫度，因此選用56℃為退火溫度。

2.2 引物對濃度優(yōu)化

根據(jù)基本PCR體系對體系內(nèi)各靶標的擴增情況，對3組PCR反應體系中12種引物的濃度進行調(diào)整，確保各組PCR產(chǎn)物在多重PCR體系中均能有效擴增擴增量接近，經(jīng)調(diào)整后各組引物加入量(10 μmmol/L)見表2。

表2 多重PCR體系中優(yōu)化的引物對加入量Tab.2 Optimized quantity of the primers in multi-PCR

2.3 雜交以及雜交條件的優(yōu)化

PCR反應體系及反應過程條件優(yōu)化完畢后，對雜交條件進行了優(yōu)化，確保PCR產(chǎn)物經(jīng)過雜交過程能夠更好的與微球結(jié)合，從而得到更高的檢測值。

2.3.1雜交溫度的優(yōu)化：雜交溫度分別選擇35℃、37℃、40℃、42℃、45℃ 5個溫度進行，以信號熒光值MFI的高低作為條件優(yōu)化的依據(jù)，結(jié)果如圖1所示，在42℃時大部分病毒檢測時得到的MFI值最高，因此選用雜交溫度為42℃。

2.3.2雜交時間的優(yōu)化：確定雜交溫度后，雜交時間分別取15、20、25、30 min，同上一部分進行雜交時間的優(yōu)化。結(jié)果如圖2所示，在雜交進行到25和30 min時所得到的MFI相近，并且12種病毒的檢測值普遍高于15和20 min，考慮到實驗快捷性，選用雜交時間為25 min。

圖1 雜交溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimized hybridization tempreture

圖2 雜交時間優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimized hybridization duration

2.4 靈敏度實驗

測定含待測病毒靶標的12種質(zhì)粒濃度，分別進行系列稀釋，PCR擴增后進行檢測，Bio-Plex Version 4.0分析，得出劑量-反應曲線(圖3)并根據(jù)方程算出檢測下限。經(jīng)計算，12種病毒檢測下限如表4所示。

圖3 雜交檢測標準曲線Fig.3 Standard curve of hybridization detection

Ⅰ組Ⅰ GroupⅡ組Ⅱ GroupⅢ組Ⅲ Group檢測病毒Virus檢測下限Lower limit of detection檢測病毒Virus檢測下限Lower limit of detection檢測病毒Virus檢測下限Lower limit of detectionEEEV0.008YF0.611 BUN8.571 WEEV2.261 WN7.073 Ban156.251 VEEV2.408 JEV0.145RVF9.752 CHIK10.012 DEN1.729SLEV9.697

2.5 特異性檢測

體系內(nèi)交叉檢測所得熒光值接近空白值，說明均與組內(nèi)其他病毒間不發(fā)生交叉反應，特異性好，結(jié)果如圖4所示。

圖4 檢測特異性驗證結(jié)果Fig.4 Evaluated result of the specific test

對墨累谷腦炎、瘧原蟲、森林腦炎病毒、流行性出血熱病毒的基因組進行檢測，熒光值均和空白值相當，表明僅與目標病毒進行反應，與其他蟲媒病原體無交叉。

2.6 實際蚊蟲樣本檢測

共研磨91份蚊蟲樣本，白紋伊蚊58只，淡色庫蚊14只，三帶喙庫蚊6只，中華按蚊13只。其中2只淡色庫蚊和7只白紋伊蚊檢出乙腦病毒，其他未檢出，與實驗室用熒光定量PCR結(jié)果一致(郭金金等，2012)，初步證明本研究建立的方法可靠，可以很好的用于實際樣品的檢測。

3 討論

蚊媒病毒主要通過蚊蟲叮咬在人群中傳播，傳播速度快、危害大，并且隨著氣候及環(huán)境的變化，有日益蔓延的趨勢(Slenning, 2010)。我國南方地區(qū)氣候潮濕、炎熱，適合多種蚊媒病毒的繁殖，且傳播媒介種類繁多，其中，許多蚊媒病毒的致病性、臨床癥狀和流行季節(jié)均十分相似并存在嚴重的血清學交叉反應(Sahetal., 2009)，因此建立特異敏感的檢測手段對該類疾病的預防治療與控制具有重要意義，建立復合檢測方法對于蚊媒病毒的監(jiān)測具有積極意義。

病毒的診斷方法主要有病毒分離培養(yǎng)、電子顯微鏡技術(shù)、血清學技術(shù)等。病毒分離法和血清學檢測方法費時繁瑣，達不到早期快速診斷的目的，免疫學方法進一步提高了靈敏度和特異性，但檢測結(jié)果也與其他的病毒存在著一定程度的交叉反應。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，一些新型檢測方法應運而生。懸浮芯片是近年來興起的一種檢測技術(shù),與常規(guī)的病原分離鑒定、瓊脂擴散試驗、血凝和血凝抑制試驗、免疫熒光法和ELISA等實驗方法相比,它具有高通量、操作簡便、重復性好、靈敏度高以及線性范圍寬等優(yōu)點,特別適合于多病原體的高通量檢測及鑒定，并已廣泛應用于各種病原體的檢測中(Iannoneetal., 2001; Liuetal., 2011; Pabbarajuetal., 2011)。

目前懸浮芯片方法中雜交所采用的主要為直接雜交法，即在檢測片段上選取一段序列作為探針，檢測前需要預先用氨基化探針對微球進行包被(羅淵, 2008)，步驟繁瑣不易操作，并且多重檢測中，由于多重探針的存在，雜交溫度的選擇也是一個技術(shù)開發(fā)時的瓶頸(Tayloretal., 2001)。x-TAG技術(shù)解決了這一問題，TAG 與anti-TAG 是基于結(jié)核分枝桿菌M.tuberculosis的序列設計而成，不含有堿基G，TAG與anti-TAG 精確互補、雜交溫度恒為37℃，但這種方法雜交前需要用帶有TAG序列的探針對第一步的擴增產(chǎn)物進行TSPE(target-specific primer extension)，以得到帶有TAG序列的單鏈片段，解決雜交溫度統(tǒng)一性的同時也帶來了耗時長，步驟繁瑣的問題(Janseetal., 2012)。本研究結(jié)合前兩種方法的優(yōu)點，將TAG直接合成至引物上，從而在PCR擴增中直接將TAG序列引入擴增產(chǎn)物，減少了實驗操作，同時大大縮短了檢測時間，并且節(jié)省了實驗所需試劑及耗材。

本實驗建立的懸浮芯片檢測方法經(jīng)與實時定量PCR比對，對蚊蟲樣品的檢測結(jié)果完全一致，并且有很好的特異性。并且由于雜交條件的同一性，所以在臨床使用時，完全可以根據(jù)樣本的不同特點，從中選擇特殊組合的微球，臨時搭配所需要的檢測體系。該懸浮芯片檢測方法的建立，不僅有利于積極開展新發(fā)傳染病的監(jiān)測、檢測、風險評估和控制的研究，還可以有效預防和控制傳染病的發(fā)生和傳播，為傳染病的流行趨勢提供預測預警信息，具有廣闊的應用前景。