薛俊宇 李 華

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系暨廣東普通高校新發(fā)傳染病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510515; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510515)

核酸檢測(cè)在寄生蟲(chóng)檢測(cè)中已發(fā)揮了重要作用，主要方法有核酸雜交、PCR、實(shí)時(shí)PCR等，但這些方法要求較高的實(shí)驗(yàn)條件，并且費(fèi)用高。自從Notomi等(2000)建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)以來(lái)，在疾病診斷中越來(lái)越受到青睞。LAMP具有操作簡(jiǎn)便、所需時(shí)間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已經(jīng)用于各種病原體的檢測(cè)及腫瘤、胚胎性別的鑒別等領(lǐng)域(Fuetal., 2011)。LAMP在檢測(cè)過(guò)程中受到多種因素的影響，在寄生蟲(chóng)病診斷方面尚處于起步階段。本文根據(jù)近年的研究進(jìn)展，對(duì)寄生蟲(chóng)LAMP檢測(cè)的影響因素及應(yīng)用進(jìn)行綜述，為寄生蟲(chóng)病診斷研究提供參考。

1 LAMP檢測(cè)寄生蟲(chóng)感染的影響因素

作為一種改良的核酸擴(kuò)增技術(shù)，LAMP相對(duì)于傳統(tǒng)PCR具有諸多優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)利用目的基因的6個(gè)靶位設(shè)計(jì)4～6個(gè)引物，在60～65℃等溫條件下，通過(guò)鏈置換反應(yīng)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能將原有的基因拷貝數(shù)擴(kuò)增至109倍。但是在檢驗(yàn)過(guò)程中，LAMP的檢測(cè)效能受多種因素影響。

1.1 靶標(biāo)基因的篩選

LAMP作為一種快捷有效的核酸檢測(cè)方法，其檢驗(yàn)?zāi)芰εc靶標(biāo)基因的選擇密切相關(guān)?；?個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)，LAMP能檢測(cè)到幾個(gè)拷貝數(shù)以上的DNA片段。在檢測(cè)寄生蟲(chóng)感染時(shí)，可選取核糖體小亞基DNA(SSU rDNA)、特異性抗原基因及分子遺傳標(biāo)記等。

1.1.1核糖體小亞基DNA：核糖體小亞基DNA是目前公認(rèn)具有廣泛的物種多態(tài)性的基因，大量研究表明，核糖體小亞基DNA在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)較多，且存在大量種屬特異性的基因位點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各類(lèi)寄生蟲(chóng)的核酸檢測(cè)中。van Eys等(1992)發(fā)現(xiàn)利什曼原蟲(chóng)SSU rDNA中央?yún)^(qū)片段動(dòng)基體基因易發(fā)生突變，是檢測(cè)動(dòng)基體目原生動(dòng)物的良好靶點(diǎn)。Fontanilla等(2008)發(fā)現(xiàn)管圓線蟲(chóng)屬SSU rDNA 5′端480 bp內(nèi)存在管圓線蟲(chóng)3期幼蟲(chóng)特異性基因位點(diǎn)。Chen等(2011)根據(jù)18S rDNA基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)福壽螺肺組織內(nèi)廣州管圓線蟲(chóng)做LAMP檢測(cè)，其特異性和敏感性均達(dá)到100%，檢驗(yàn)極限達(dá)1 fg/μL。Han等(2007)根據(jù)四種瘧原蟲(chóng)18S rDNA成功實(shí)現(xiàn)了LAMP的血清中瘧原蟲(chóng)檢測(cè)。鑒于上述成功的案例，SSU rDNA可作為寄生蟲(chóng)LAMP檢測(cè)的候選靶標(biāo)基因。

1.1.2特異性抗原基因： 隨著ELISA等免疫學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用，大量的特異性抗原被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于病原體的臨床診斷中，而這些特異性抗原基因也逐漸應(yīng)用于核酸檢測(cè)中。Lau等(2011)根據(jù)諾氏瘧原蟲(chóng)頂端膜抗原-1(apical Membrane antigen-1,AMA-1)設(shè)計(jì)引物，對(duì)74例血液樣本做AMA-1 LAMP檢測(cè)，與 SSU rDNA特異性巢式PCR對(duì)比，其敏感性及特異性均為100%。 Wang 等(2012)根據(jù)布氏錐蟲(chóng)屬M(fèi)APK5(TbMAPK5)設(shè)計(jì)引物，對(duì)涎傳錐蟲(chóng)亞屬TbMAPK5 LAMP 的檢驗(yàn)極限達(dá)到 1 000 蟲(chóng)體/mL。Iseki等(2007)利用牛巴貝蟲(chóng)的棒狀體相關(guān)蛋白-1(rhoptry associated protein-1,RAP-1),通過(guò)在同一反應(yīng)體系設(shè)計(jì)兩套不同基因的引物，對(duì)牛血清中牛巴貝蟲(chóng)B.bovis和雙芽巴貝蟲(chóng)B.bigemina進(jìn)行多重LAMP檢測(cè)，檢驗(yàn)極限是傳統(tǒng)PCR的105倍和巢式PCR的103倍。因此，特異性抗原基因可作為寄生蟲(chóng)潛在靶標(biāo)基因。

1.1.3分子遺傳標(biāo)志： 在寄生蟲(chóng)病流行地區(qū)通常多種寄生蟲(chóng)并存。免疫診斷時(shí)常出現(xiàn)交叉陽(yáng)性反應(yīng)難以鑒別，因此，種屬特異性核酸檢測(cè)顯得尤為重要。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)的長(zhǎng)度和序列變化較大，可用于生物的種屬鑒定。ITS-1區(qū)域受外界環(huán)境因素的影響較小，進(jìn)化速度較快，是系統(tǒng)發(fā)育分析的重要分子標(biāo)記(Chuetal., 2001)，同時(shí)也是檢測(cè)寄生蟲(chóng)基因多態(tài)性的一個(gè)重要基因(崔立云與張霄霄等, 2012)。Liu等(2013)利用ITS-LAMP成功區(qū)分瑟氏泰勒蟲(chóng)Theileriasergenti和中華泰勒蟲(chóng)Theileriasinensis。Liu等(2012)根據(jù)廣州管圓線蟲(chóng)ITS-2基因?qū)衷片旇輧?nèi)廣州管圓線蟲(chóng)做LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示其檢驗(yàn)極限可達(dá)0.1 fg/μL。另外，線粒體DNA(mtDNA)與核DNA 的復(fù)制相對(duì)獨(dú)立且無(wú)內(nèi)含子， 其基因組的某些區(qū)域的序列進(jìn)化速率相對(duì)較快，如細(xì)胞色素C 氧化酶3個(gè)亞基的編碼基因(COⅠ、COⅡ和COⅢ)也是理想的分子遺傳標(biāo)志，在寄生蟲(chóng)地理株檢測(cè)方面具有高度特異性(崔立云與張霄霄等, 2012)。

選擇靶基因時(shí)，LAMP對(duì)靶基因片段的長(zhǎng)度亦有限制。由于鏈置換反應(yīng)對(duì)于LAMP的限制，其靶標(biāo)基因的長(zhǎng)度應(yīng)選擇在300 bp左右，若超過(guò)500 bp,則會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增量的減小，不適合作為L(zhǎng)AMP靶標(biāo)基因(Lauetal., 2011)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

引物在核酸檢測(cè)中起關(guān)鍵性作用，引物設(shè)計(jì)的基本原則在此不作贅述。LAMP需根據(jù)靶標(biāo)基因的6個(gè)靶點(diǎn)(F1-3，B1-3)設(shè)計(jì)2對(duì)引物。目前多采用PrimerExplorer (Eiken, Japan http://primerexplorer.jp/e/)或者LAMP Designer(PREMIER Biosoft, USA)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(Notomietal., 2000; Tomlinson, 2013)。環(huán)狀引物(loop Primer)根據(jù)LAMP產(chǎn)生的莖環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可以與莖環(huán)結(jié)構(gòu)雜交而激活新一輪的擴(kuò)增，一般為左右兩條。若沒(méi)有足夠的環(huán)狀引物的位點(diǎn)，可設(shè)計(jì)單條引物或者不添加環(huán)狀引物。使用環(huán)狀引物可明顯縮短LAMP的反應(yīng)時(shí)間，提高LAMP的檢驗(yàn)極限(Nagamineetal., 2002)。Njiru(2008) 等利用LAMP檢測(cè)布氏錐蟲(chóng)小鼠血清抗體相關(guān)基因(SRA gene)時(shí)，發(fā)現(xiàn)加入環(huán)狀引物后LAMP最佳反應(yīng)時(shí)間由原來(lái)的50 min縮短至20～25 min，且檢驗(yàn)極限由原來(lái)的 1 000 蟲(chóng)體/mL降至1蟲(chóng)體/mL。

1.3 樣本采集與處理

1.3.1樣本的采集：目前LAMP檢測(cè)可選的樣本有腦脊液、血清、熱處理的全血、組織、排泄物等。檢測(cè)時(shí)，需根據(jù)寄生蟲(chóng)特點(diǎn)和寄生部位進(jìn)行采樣。對(duì)于不同蟲(chóng)株，由于診斷意義不同，取樣部位也不同。如檢測(cè)布氏錐蟲(chóng)宜采用血液樣本，而檢驗(yàn)二期人類(lèi)非洲錐蟲(chóng)病(Human African Trypanosomiasis,HAT)則選用腦脊液標(biāo)本(Njiruetal., 2011; Wangetal., 2012)。LAMP檢測(cè)的樣本來(lái)源詳情見(jiàn)表1。Flinders Technology Associated研制的FTA ?試紙能夠在室溫下長(zhǎng)期保存，簡(jiǎn)化操作步驟，減少DNA提取過(guò)程中交叉感染的可能性，適用于現(xiàn)場(chǎng)樣本的采集(Yamamuraetal., 2009)。

1.3.2樣本的預(yù)處理：由于Bst DNA多聚酶對(duì)于血漿中的多聚酶敏感度較低，因此，理論上LAMP檢測(cè)的樣本可不經(jīng)處理，但利用表面活性劑預(yù)處理瘧原蟲(chóng)標(biāo)本可以提高LAMP的診斷效能(Grabetal., 2011)。常用的表面活性劑有Triton X-100和Tween-20等非離子型表面活性劑。某些原蟲(chóng)(如隱孢子蟲(chóng)等)由于其卵囊與人類(lèi)細(xì)胞膜融合，表面出現(xiàn)脂筏結(jié)構(gòu)，對(duì)氯和非離子表面活化劑耐受性增加(Sekikawaetal., 2011)，因此，主要采用凍融法。在樣本處理時(shí)若使用SDS，所獲得的DNA還需純化。Sekikawa(2011)發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲(chóng)LAMP檢測(cè)中用十二烷基肌氨酸鈉(n-lauroylsarcosine sodium salt,LSS)代替SDS可以省略DNA純化的步驟，但要注意使用濃度。0.01% LSS對(duì)Bst DNA無(wú)抑制作用，但大于0.1%的LSS對(duì)Bst DNA有抑制作用。作者在隱孢子蟲(chóng)樣本中先用0.1%LSS處理，有效的從卵囊中提取DNA之后再加入5% Triton X-100 或Tween-20處理，使LSS濃度降至0.01%，從而減少LSS對(duì)Bst DNA的抑制作用。

表1 各類(lèi)寄生蟲(chóng)LAMP檢驗(yàn)情況Tab.1 Summary of LAMP detection of parasite in previous study

續(xù)表1Tab.1continued

分類(lèi)Category種屬Species檢測(cè)基因/GeneBank序列號(hào)Gene/GeneBank Accessary No.樣本來(lái)源 Specimen環(huán)Loop反應(yīng)溫度Reacting temperature檢驗(yàn)極限D(zhuǎn)etecting limit參考文獻(xiàn)ReferenceT.annulataAnkara hypothetical protein(TA04795)Blood+6310 pg/μLSalih et al., 2008T. evansiVSG gene (AJ870486)Blood+630.1 parasites/mLNjiru et al., 2010T. sergentip33(D87198)Blood-630.000002% para-sitemiaWang et al., 2010T. sergenti NingxianITS(EF547930)Blood-6110 fg/μLLiu et al., 2013T. sinensis WeiyuanITS(EF547932)Blood-6310 fg/μLTheileria parvap150 L47230Blood+63100 fgThekisoe et al., 2010PIM L41833Blood+60100 fg吸蟲(chóng)O.viverriniITS-1 (EU038151)Feces+651 pg/μLArimatsu et al., 2012TrematodeP.westermaniITS-2(AF159604)Multi-2+600.01 fg/μLChen et al., 2011S.japonicum28S ribosomal DNA (Z46504)Tissue-65100 fg/μLKumagai et al., 2010SjR2 (AF412221)Blood-650.08 fg/μLXu et al., 2010S.haematobiumDraI(DQ157698.1)Tissue-630.1 fg/μLAbbasi et al., 2010S.mansoniSm1-7(M61098.1)Tissue-630.1 fg/μL線蟲(chóng)A.cantonensis18S rRNA (AY295804.1)Tissue-651 fg/μLChen et al., 2011NematodeITS1(GU587760.1)Tissue-650.1fg/μLLiu et al., 2011W.bancroftiscaffold/matrix attachment region(AY297458)Blood-620.1 pg/μLTakagi et al., 2011B.malayiHha I(M12691)Blood+630.01 ngPoole et al., 2012絳蟲(chóng)T.saginataTsag-cox1 (AB441816)Feces-635 EPGNkouawa et al., 2010TeaniaT.asiaticaTasi-cox1 (AB441817)Feces-635 EPGT.soliumTsol-cox1 (AB441815)Feces-631 copies/tubeEchinococcus granulosus12S rRNA(AF297617)Eggs-631 egg/200 μL徐祥珍等, 2011巴貝斯蟲(chóng)B.gibsoni18S rDNA (AF205636)Blood-630.0005% para-sitemia1Ikadai et al., 2004BabesiaB.bovisRAP-1 (AF027149)Blood-640.0001% para-sitemia1Iseki et al., 2007B.bigeminaRAP-1 (M60878)Blood-640.00001% para-sitemia1B.canisputative rhoptry protein gene (M91168)Blood-6425 pg/μLMuller et al., 2010隱孢子蟲(chóng)C.hominisSAM geneFeces+63-Bakheit et al., 2008Cryptosporidi-umC.meleagridisC.parvumgp60(AB237136)Feces+63-C.andersoniHSP-70(DQ989577)Feces+63-C.bovis18SrRNA(3873244)Feces-65-阿米巴E.histolyticaSSU rDNA (X64142)Feces-631 parasites/tubeLiang et al., 2009AmoetaAcanthamoeba spp.18S rRNAParasite-6510 pg/μLLek-Uthai et al., 2009

1 1% 寄生蟲(chóng)血=5×107受感染紅細(xì)胞/200 μL。1% parasitemia=5×107infected RBC/200 μL.

2 此反應(yīng)中樣本包括血液樣本和痰液樣本。The samples contains Blood and sputum samples.

1.3.3DNA提?。撼Ｓ玫腄NA提取方法有加熱法、濾紙法等，也有商業(yè)化DNA提取試劑盒。由于血液樣本中含有大量球蛋白，抑制Taq DNA多聚酶活性，因此，PCR在提取DNA后必須進(jìn)行純化。而B(niǎo)st DNA多聚酶對(duì)血漿中的多聚酶抑制物質(zhì)敏感度較低，因此，理論上LAMP不需要DNA純化。Lucchi(2010)等在對(duì)比煮沸法與商業(yè)試劑盒提取DNA的效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用煮沸法時(shí)LAMP檢驗(yàn)極限為4個(gè)蟲(chóng)體/mL，而試劑盒則能達(dá)到0.4個(gè)蟲(chóng)體/mL。這可能與試劑提取DNA的操作流程標(biāo)準(zhǔn)化以及DNA的純度較高有關(guān)。因此，建立LAMP方法時(shí)應(yīng)根據(jù)診斷效能選用合適的DNA提取方法，并建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程。

1.4 LAMP反應(yīng)

1.4.1反應(yīng)體系：目前LAMP法反應(yīng)體系為25 μL，體系包含F(xiàn)IP和BIP，F(xiàn)3和B3，dNTPs， Tris-HCl(pH 8.8),KCI,MgSO4,(NH4)S04,Tween-20,Betaine和Bst DNA聚合酶(8 U/μL)。當(dāng)建立一個(gè)新的反應(yīng)體系時(shí)需要優(yōu)化MgSO4和Betaine的濃度(Tomlinson, 2013)。

1.4.2DNA多聚酶： 目前大多數(shù)LAMP使用的是Bst多聚酶。近年市場(chǎng)上出現(xiàn)了一些新型的多聚酶，如New England公司的Bst多聚酶的大片段Bst2.0和OptiGene 的Isothermal Master Mix，能縮短LAMP的反應(yīng)時(shí)間(Pooleetal., 2012)。提高DNA多聚酶的效能將成為今后LAMP技術(shù)提升的重要因素(Morietal., 2013)。

1.4.3反應(yīng)溫度：LAMP擴(kuò)增主要是依靠BstDNA多聚酶進(jìn)行DNA的復(fù)制，溫度可影響B(tài)stDNA的活性。大多數(shù)LAMP反應(yīng)的最適宜溫度為60～65℃，部分反應(yīng)在62～66℃。(Tomlinson, 2013) 在反應(yīng)結(jié)束時(shí)應(yīng)當(dāng)以80～90℃加熱2～5 min以終止擴(kuò)增反應(yīng)。當(dāng)建立一種新的LAMP檢測(cè)體系時(shí)，可設(shè)立一定的溫度梯度，通過(guò)比較其反應(yīng)時(shí)間及檢驗(yàn)極限得出其最佳溫度。各種寄生蟲(chóng)LAMP檢測(cè)的最適宜溫度見(jiàn)表1。

1.4.4反應(yīng)時(shí)間： 大多數(shù)LAMP的反應(yīng)時(shí)間為60 min，也有超過(guò)90 min的報(bào)道。但超過(guò)90 min后不僅無(wú)法提高LAMP的敏感性，同時(shí)可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)建立一種新的LAMP檢測(cè)體系時(shí)，可在25 μL體系最適溫度下設(shè)立一定的時(shí)間梯度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)DNA條帶亮度選擇最亮條帶對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間作為最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.5 LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)

LAMP在擴(kuò)增的同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，使反應(yīng)體系變渾濁，通過(guò)濁度的對(duì)比，可直觀的了解LAMP的擴(kuò)增情況。目前常用的LAMP產(chǎn)物檢測(cè)方法包括凝膠電泳、熒光檢測(cè)法、實(shí)時(shí)濁度法等。

1.5.1凝膠電泳法： 凝膠電泳是最常用的產(chǎn)物檢測(cè)方法之一。亦可先用限制性?xún)?nèi)切酶將擴(kuò)增產(chǎn)物剪切，電泳可檢測(cè)到特異性核酸條帶。該法穩(wěn)定可靠，但費(fèi)時(shí)。

1.5.2UV法： 在反應(yīng)前加入能使dsDNA染色的熒光劑?？蛇x用SYRB GREEN I、SYTO-9和FD等對(duì)BstDNA多聚酶抑制程度較輕的熒光顯色劑。自然光下呈綠色，紫外光下發(fā)出綠色熒光。該方法簡(jiǎn)便快捷，可直觀的反映LAMP擴(kuò)增情況。但UV法只能定性判斷LAMP是否擴(kuò)增，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。值得注意的是往反應(yīng)管中添加染料時(shí)容易造成污染而引起假陽(yáng)性。

1.5.3實(shí)時(shí)濁度法(real-time turbidimeter method)：實(shí)時(shí)濁度法可以實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的白色沉淀，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP反應(yīng)全程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。同時(shí)，實(shí)時(shí)濁度法簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了反應(yīng)體系污染，降低了假陽(yáng)性的幾率，但價(jià)格較為昂貴。

2 LAMP在寄生蟲(chóng)病檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值

LAMP作為新一代的核酸檢測(cè)技術(shù)，具有高度特異性與敏感性，在呼吸道病毒、HIV、大腸桿菌、結(jié)核桿菌等檢測(cè)中取得了較好的效果(Sankaretal., 2011)。對(duì)痰檢陽(yáng)性標(biāo)本具有較高的敏感性，達(dá)到97.7% (173/177)(Neonakisetal., 2011)。

在寄生蟲(chóng)檢測(cè)方面，LAMP已應(yīng)用于部分寄生蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查，如瘧原蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、巴貝斯蟲(chóng)、泰勒蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)等。目前，瘧原蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、人類(lèi)非洲錐蟲(chóng)等已經(jīng)進(jìn)入臨床檢驗(yàn)研究階段(2012)。Eiken公司已經(jīng)推出瘧疾的LoopAmpTM試劑盒并利用其進(jìn)行了場(chǎng)地檢測(cè)。Heidi Hopkins等(2013)利用LAMP試劑盒檢測(cè)烏干達(dá)272名門(mén)診病人血清樣本，結(jié)果顯示在P.falciparumqPCR 效價(jià)≥2 蟲(chóng)體/μL的樣本中，LAMP的敏感性為97.8% (95%CI 93.7%～99.5%)。在利什曼原蟲(chóng)檢測(cè)方面，Verma等(2013)利用杜氏利什曼原蟲(chóng)動(dòng)基體DNA(Kinetoplast Minicircle DNA)對(duì)新德里采集的55份惡性利什曼原蟲(chóng)(VL)靜脈血樣本、15份惡性利什曼原蟲(chóng)(VL)骨髓樣本和62份黑熱病皮膚利什曼病(PKDL)的組織學(xué)樣本做LAMP檢測(cè)，其敏感性均大于96%，特異性為98.5%。LAMP用于寄生蟲(chóng)檢測(cè)的詳情見(jiàn)表2。

表2 LAMP在寄生蟲(chóng)檢測(cè)中的應(yīng)用情況Tab.2 Summary of LAMP sensitivity and specificity in the detection of parasite in some previous studies

1.YD指數(shù)=(敏感性+特異性)-1 YD Index=(sensitivity+Specificity)-1。

3 問(wèn)題與展望

LAMP方便快捷，操作簡(jiǎn)易，具有高度的敏感性和特異性，在臨床診斷和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)有一定優(yōu)勢(shì)。由于敏感性過(guò)高，LAMP在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)過(guò)程中，很有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，建立LAMP檢測(cè)體系時(shí)，應(yīng)充分考慮各方面的影響因素(表3)，優(yōu)化反應(yīng)條件，以減低非特異性擴(kuò)增，提高檢測(cè)的特異性。

表3 LAMP反應(yīng)因素Tab.3 Summary of the influence factor in LAMP reaction

LAMP從Kuboki等(2003)首次檢測(cè)人類(lèi)非洲錐蟲(chóng)病病原體以來(lái)，在病原檢測(cè)方面得到了迅速發(fā)展。簡(jiǎn)化反應(yīng)流程，減少反應(yīng)體系，樣本傳送及μTAS技術(shù)的應(yīng)用已成為未來(lái)LAMP的發(fā)展趨勢(shì)，通過(guò)減少假陽(yáng)性的發(fā)生率，降低成本，進(jìn)一步為L(zhǎng)AMP成為臨床快速檢測(cè)創(chuàng)造條件(Morietal., 2013)。LAMP與微流體芯片技術(shù)的結(jié)合使得病原體重點(diǎn)照護(hù)檢驗(yàn)(Point-of-care test,POCT)成為可能(Morietal., 2009)，并已經(jīng)嘗試對(duì)大腸桿菌(Safaviehetal., 2012)，沙門(mén)氏菌(Hsiehetal., 2012)等細(xì)菌(Fangetal., 2012)及HIV等病毒(Sunetal., 2013)進(jìn)行快速檢測(cè)。

盡管LAMP在多數(shù)寄生蟲(chóng)的檢測(cè)中尚處于研究階段，隨著研究的不斷深入和現(xiàn)場(chǎng)試用的范圍擴(kuò)大，LAMP作為新一代核酸檢測(cè)技術(shù)將在寄生蟲(chóng)病的診斷和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。