莫蓓莘，黃 彪，劉 麗，葉 浩，徐曉峰

1)深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060;2)深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物技術(shù)與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060

在種子發(fā)育過(guò)程中，胚完成發(fā)育、成熟和生理干燥后，進(jìn)入相對(duì)靜止期，直到溫濕度和光照等條件滿(mǎn)足了才開(kāi)始萌發(fā)［1］.目前已在多種處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的植物干種子中發(fā)現(xiàn)大量mRNA存在［2-4］，說(shuō)明這些mRNA(又稱(chēng)為長(zhǎng)壽命mRNA［5］)能存在于干燥環(huán)境中并保持活力.儲(chǔ)存mRNA最早在成熟的棉花干種子中發(fā)現(xiàn)［6］，隨后研究者們對(duì)擬南芥干種子轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析，鑒定出10 000多種儲(chǔ)存mRNA［7-9］;在大麥和水稻干種子中也發(fā)現(xiàn)相似數(shù)目的儲(chǔ)存mRNA［10-12］;對(duì)大豆干種子基因微陣列的分析發(fā)現(xiàn)，其至少含有22 000種儲(chǔ)存 mRNA［13］.這些儲(chǔ)存mRNA被認(rèn)為可能在種子萌發(fā)早期參與蛋白質(zhì)的合成，但這些貯存mRNA存在于干種子細(xì)胞的什么部位?在萌發(fā)過(guò)程中有何功能?如何在萌發(fā)過(guò)程參與蛋白質(zhì)的合成?種子能否完全依賴(lài)儲(chǔ)存mRNA完成萌發(fā)過(guò)程?對(duì)于這些問(wèn)題，我們知之甚少.近年研究發(fā)現(xiàn):酵母、哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞中存在被稱(chēng)為脅迫顆粒的mRNA儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)和被稱(chēng)為處理小體 (或P-body)的mRNA降解結(jié)構(gòu).這些結(jié)構(gòu)通過(guò)抑制 (將mRNA降解)或延遲 (將mRNA運(yùn)送回多核糖體)特異mRNA的翻譯實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控.逆境條件下，mRNA通過(guò)在多核糖體、脅迫顆粒和處理小體之間轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控特異蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而使其所在的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對(duì)逆境的適應(yīng)［14-16］.如熱脅迫誘導(dǎo)下，在擬南芥根尖細(xì)胞和煙草葉肉原生質(zhì)體中可以觀(guān)察到處理小體和脅迫顆粒的數(shù)量和大小都有所增加［17］，該研究結(jié)果表明，儲(chǔ)存mRNA的脅迫顆粒和降解mRNA的處理小體對(duì)植物適應(yīng)逆境有重要作用.種子發(fā)育成熟后即進(jìn)入生理干燥期，種子細(xì)胞在該時(shí)期脫水，類(lèi)似干旱脅迫;在萌發(fā)過(guò)程浸泡吸水相當(dāng)于脅迫解除，恢復(fù)自然狀況.種子發(fā)育和萌發(fā)過(guò)程基因表達(dá)，是否也通過(guò)mRNA在細(xì)胞內(nèi)脅迫顆粒、處理小體以及多核糖體之間的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控?萌發(fā)所需的mRNA是否在種子發(fā)育后期合成、干燥期被運(yùn)送到mRNA儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)中?種子吸水后，mRNA即離開(kāi)儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)被運(yùn)送到多核糖體中，為種子吸水后迅速開(kāi)展的蛋白質(zhì)合成提供mRNA模版?本研究以大豆胚根為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制劑處理種子，分析在mRNA合成被抑制時(shí)，種子能否依賴(lài)儲(chǔ)存的mRNA完成萌發(fā)過(guò)程.根據(jù)不同萌發(fā)階段mRNA在種子細(xì)胞儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)和多核糖體之間量的變化，探討mRNA在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制是否參與種子發(fā)育和萌發(fā)過(guò)程基因表達(dá)的調(diào)控.

1 材料與方法

1.1 植物材料與萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

利用轉(zhuǎn)錄抑制劑α－鵝膏蕈堿(α-amanitin)抑制新的mRNA合成，或利用翻譯抑制劑抑制新蛋白質(zhì)的合成，必須使抑制劑透過(guò)種皮進(jìn)入胚細(xì)胞內(nèi)，且處理方法不能影響胚的活力.大豆胚根易從種子中剝離，且能保持胚根活力，胚根可直接與轉(zhuǎn)錄抑制劑接觸，避免了種皮和子葉阻礙胚對(duì)抑制劑的吸收.因此，本研究采用大豆胚根作為實(shí)驗(yàn)材料，大豆華夏一號(hào)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)王曉峰教授提供.

將大豆干種子分為2組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每份樣品為100 mg干種子胚根.將其中一組胚根分別置于裝有去離子水、0.4 mmol/L轉(zhuǎn)錄抑制劑 αaminitin溶液或100 μg/mL翻譯抑制劑放線(xiàn)菌酮(cycloheximide，CHX)溶液的培養(yǎng)皿中;另一組種子用沸水浴處理2 min，之后將剝離的胚根浸泡在去離子水中，置于25℃黑暗環(huán)境中.處理時(shí)間分別為0、4、8、12、16和20 h.

1.2 萌發(fā)過(guò)程中不同亞細(xì)胞器的分離

分別取浸泡0和4 h的胚根200 mg，加入1 mL裂解緩沖液 (Hepes-KOH 40 mol/L，pH=7.2;KCl 10 mmol/L，EDTA 0.1 mmol/L，Heparin 1 mg/mL，CHX 100 μg/mL，DTT 10 mmol/L，蔗糖 50 g/L，Triton X-100體積分?jǐn)?shù)為1%)，充分研磨，將研磨液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，11 400 r/min，4℃，離心10 min;取上清液0.3 mL，分別加至質(zhì)量濃度為100～400 g/L連續(xù)蔗糖密度梯度溶液的頂端，4℃，45 000 r/min(SW60Ti，Beckman)，離心2.5 h，自上往下收集分離液，每管60 μL，測(cè)260 nm處光密度值 (optical density，OD)，根據(jù)吸收值繪制萌發(fā)0 h和萌發(fā)4 h的胚根細(xì)胞多核糖體特征圖譜，根據(jù)吸收峰確定多核糖體組分和非多核糖體組分［18-19］.

1.3 提取RNA并合成cDNA

采用Trizol法［20］提取大豆胚根總RNA，按試劑公司 (Invitrogen)提供的操作說(shuō)明進(jìn)行，每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每份樣品重復(fù)3次，測(cè)定濃度并電泳檢測(cè).

經(jīng)蔗糖密度梯度離心得到多核糖體組分和非多核糖體組分中的RNA，用酚氯仿法［21］提取.測(cè)定RNA濃度并電泳檢測(cè).

取900 ng RNA，按PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara Biotechnology(大連)有限公司)的說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA.

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR及數(shù)據(jù)分析

選取大豆膨脹素 (soybean expansin)基因(se)和β－微管蛋白 (soybean beta-tubulin)基因(sbt)為目的基因.其中，se上游引物序列為5'-GCAACCCACCACTCAAGCA-3'，下游引物序列為 5'-TGAAATAGCACGGGACGA-3';sbt上游引物序列為5'-ACCGGGCTTTGACTGTTCC-3'，下游引物序列為5'-TCATCTGTTCATCCACCTCCTTT-3'，以 cDNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收，連接到T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌.提取大腸桿菌質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品.

取1 ng含有目的基因的重組質(zhì)粒，按10倍梯度稀釋?zhuān)?0－1～10－7ng/μL做標(biāo)準(zhǔn)品用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).使用Takara公司SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)反應(yīng)，反應(yīng)體系大小為 20 μL，模板為2 μL，正反向10 μmol/L引物各0.8 μL.其他按該試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作.每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行.

種子相關(guān)的實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)將干種子中的目的基因的拷貝數(shù)設(shè)置為1，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理.而細(xì)胞組分分離相關(guān)定量以結(jié)果最小的設(shè)為1，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理.

1.5 蛋白質(zhì)電泳和Western blot分析

分別從大豆干種子胚根、浸泡在水或轉(zhuǎn)錄抑制劑中的胚根中提取總蛋白質(zhì).將蛋白質(zhì)樣品與5倍的蛋白質(zhì)上樣緩沖液 (由pH=6.8的Tris-HCl 0.3 mol/L，SDS 100 g/L，Glyin 500 g/L，2-mercaptoethanol 50 g/L和Bromophenol blue 0.5 g/L配制而成)混合;100℃加熱5 min后，上樣 (聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量濃度為100 g/L)，100 V電泳3～4 h;最后，將凝膠板上的蛋白轉(zhuǎn)到纖維膜上.

轉(zhuǎn)膜所用緩沖液為Dunn buffer(10 mmol/L NaHCO3，3 mmol/L Na2CO3);轉(zhuǎn)膜電壓55 V，時(shí)間75 min.轉(zhuǎn)膜后，將纖維膜在體積分?jǐn)?shù)為5%的牛奶中浸泡1 h，用PBST(1×PBS，0.5%Tween-20)洗3次，每次10 min.在初級(jí)抗體中搖晃浸泡1 h后，再用PBST洗3次，每次10 min.然后在二級(jí)抗體中搖晃下浸泡45 min，再用PBST洗3次，每次10 min.最后用加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒 (Amersham pharmacia biotech inc.)進(jìn)行檢測(cè)，具體操作按制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆干種子中含有萌發(fā)所需蛋白的mRNA

儲(chǔ)存 mRNA 被發(fā)現(xiàn)存在于棉花［6］、苜蓿［18］、擬南芥［7］、水稻［10-11］和大豆［13］等多種植物的干種子中，其功能尚不清楚.如果儲(chǔ)存mRNA在種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮作用，那么萌發(fā)過(guò)程所需蛋白的mRNA應(yīng)存在于干種子中.實(shí)驗(yàn)選取大豆種子萌發(fā)過(guò)程必需的幾種基因作為標(biāo)記物，包括β－微管蛋白 (β-tubulin)、膨脹素 (expansin)、谷氨酰胺合成酶 (glutamine synthetase)和脂氧合酶 (lipoxygenase)，檢測(cè)干種子中是否儲(chǔ)存這些基因的mRNA.RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn):在4種標(biāo)記物基因大小對(duì)應(yīng)位置均有明顯的條帶 (圖1)，說(shuō)明大豆干種子中存在4種基因的mRNA.因此推測(cè)，儲(chǔ)藏在干種子中的mRNA可能在種子萌發(fā)過(guò)程中為該過(guò)程所需蛋白質(zhì)的翻譯提供模板.

圖1 RT-PCR檢測(cè)大豆干種子中萌發(fā)相關(guān)基因mRNA的存在Fig.1 Detection of the existence of germination related mRNAs in soybean dry seed

2.2 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)大豆胚根中mRNA合成的抑制效果

實(shí)驗(yàn)選取大豆種子萌發(fā)過(guò)程所需膨脹素基因(se)和β－微管蛋白基因(sbt)作為基因標(biāo)記物，利用RT-qPCR技術(shù)分析萌發(fā)過(guò)程轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)大豆胚根中mRNA合成的抑制情況.圖2顯示萌發(fā)過(guò)程中轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)大豆胚根中mRNA合成的抑制效果.結(jié)果表明，與干種子相比，對(duì)照組從吸漲開(kāi)始至吸漲8 h，se和sbt基因的表達(dá)量均呈逐漸上升趨勢(shì)，8 h后兩種基因的表達(dá)量都逐漸下降.而轉(zhuǎn)錄抑制組自吸漲開(kāi)始，se的表達(dá)量隨吸漲時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯降低趨勢(shì)，sbt的表達(dá)量至吸漲4 h略有上升，然后明顯降低.這表明轉(zhuǎn)錄抑制劑在吸漲開(kāi)始后迅速滲入胚根細(xì)胞的細(xì)胞核中并抑制mRNA合成，作用效果顯著.

2.3 轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)大豆胚根中蛋白質(zhì)合成的影響

結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)大豆胚根中mRNA合成的抑制效果，為探討轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)大豆胚根中蛋白質(zhì)合成的影響，實(shí)驗(yàn)利用Western blot對(duì)大豆胚根萌發(fā)過(guò)程谷氨酰胺合成酶的表達(dá)水平進(jìn)行分析.圖3結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄抑制劑處理4和8 h后，谷氨酰胺合成酶的表達(dá)水平相對(duì)于干種子均有升高，說(shuō)明在轉(zhuǎn)錄被抑制的條件下，大豆胚根能利用儲(chǔ)存的mRNA繼續(xù)合成蛋白質(zhì)，為種子順利完成萌發(fā)過(guò)程提供必需的蛋白質(zhì).與浸泡在水中的大豆胚根樣品比較，浸泡在轉(zhuǎn)錄被抑制的大豆胚根樣品中的谷氨酰胺合成酶的表達(dá)水平更低，顯示新合成的mRNA被抑制后，蛋白質(zhì)的合成所需的模板減少，從而使新蛋白質(zhì)合成的速度減慢.轉(zhuǎn)錄抑制條件下，種子萌發(fā)速度減慢與蛋白質(zhì)合成速度的降低密切相關(guān).SDSPAGE顯示的蛋白質(zhì)主要是種子中的儲(chǔ)存蛋白，這些蛋白質(zhì)在種苗的生長(zhǎng)過(guò)程將被降解為種苗的發(fā)育提供養(yǎng)分.

圖2 大豆胚根萌發(fā)過(guò)程se和sbt mRNA的定量分析Fig.2 Quantitative analysis of the mRNAs of se(a)and sbt(b)during the germination of soybean radicle

2.4 轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)大豆胚根萌發(fā)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄抑制劑濃度為0.4 mmol/L時(shí)能顯著抑制大豆胚根中mRNA的合成.在轉(zhuǎn)錄被抑制時(shí)，胚根能否完成萌發(fā)?如圖4，實(shí)驗(yàn)以浸泡在水中的大豆胚根為對(duì)照組;以浸泡在0.4 mmol/L的α-amanitin溶液中的大豆胚根為se處理組;為區(qū)分大豆胚根的伸長(zhǎng)是萌發(fā)結(jié)果還是吸水膨脹結(jié)果，用沸水浴處理后的大豆胚根浸泡在水中作為sbt處理組.圖4結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆干種子胚根長(zhǎng)為4.3 mm，經(jīng)沸水煮過(guò)后，sbt處理組胚根伸長(zhǎng)至6.4 mm;浸泡4 h后，對(duì)照組和se處理組的胚根伸長(zhǎng)至7.3 mm，sbt處理組胚根長(zhǎng)度沒(méi)有變化;8 h后，對(duì)照組胚根伸長(zhǎng)至8 mm，而se處理組的胚根伸長(zhǎng)至7.5 mm;sbt處理組胚根長(zhǎng)度依然沒(méi)有變化.之后隨著萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組胚根繼續(xù)伸長(zhǎng)，而se和sbt處理組不再變化.相比之下，大豆胚根有顯著伸長(zhǎng)，說(shuō)明這種伸長(zhǎng)是由于胚細(xì)胞的生長(zhǎng)而不單純是由于吸水膨脹.表明大豆胚根在轉(zhuǎn)錄被抑制的條件下依賴(lài)儲(chǔ)存mRNA可以完成萌發(fā)過(guò)程.大豆胚根伸長(zhǎng)一定程度后停止生長(zhǎng)，說(shuō)明儲(chǔ)存mRNA只能提供大豆胚根完成萌發(fā)過(guò)程，不能滿(mǎn)足萌發(fā)后種苗的生長(zhǎng)過(guò)程蛋白質(zhì)翻譯的需要.

圖3 通過(guò)Western blot分析大豆胚根萌發(fā)過(guò)程谷氨酰胺合成酶的表達(dá)水平 (a)，SDS-PAGE顯示相同的總蛋白上樣量 (b)Fig.3 Analysis of protein levels of glutamine synthetase during germination process by Wesrtern blot(a)，SDS-PAGE showing equal amount of total proteins(b)

圖4 轉(zhuǎn)錄抑制劑處理對(duì)大豆胚根萌發(fā)的影響Fig.4 The effects of transcription inhibitor on the germination of soybean radicle

2.5 不同萌發(fā)時(shí)間大豆胚根細(xì)胞中mRNA亞細(xì)胞定位的變化

2.4節(jié)的結(jié)果顯示，大豆胚根可依賴(lài)干種子中儲(chǔ)存的mRNA完成萌發(fā).干種子中處于儲(chǔ)存狀態(tài)的mRNA和萌發(fā)過(guò)程中處于翻譯狀態(tài)的mRNA是否發(fā)生了亞細(xì)胞定位的變化?為探明這個(gè)問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)將干種子胚根和處于萌發(fā)過(guò)程的胚根分別研磨后，進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，分離不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同樣以se和sbt作為基因標(biāo)記物，通過(guò)RT-qPCR分析mRNA在不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)間的分布.圖5可見(jiàn)，干種子胚根中的mRNA主要存在于核糖體外的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，即mRNA的儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)中，浸泡4 h的胚根中的mRNA主要存在于多核糖體中.說(shuō)明萌發(fā)所需的mRNA在種子發(fā)育的后期合成，并被運(yùn)送到多核糖體外的mRNA儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)中，種子吸水后，mRNA應(yīng)離開(kāi)儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)被運(yùn)送到多核糖體中為隨后迅速開(kāi)展的蛋白質(zhì)合成提供mRNA模板.

圖5 大豆胚根萌發(fā)過(guò)程不同時(shí)間mRNA在不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的量的變化Fig.5 The changes of mRNAs levels in different subcellular structures after different time of imbibition

2.6 萌發(fā)過(guò)程不同階段多核糖體特征圖譜分析

2.5節(jié)的結(jié)果表明，干種子中mRNA主要位于核糖體外的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，浸泡一定時(shí)間后，mRNA大部分轉(zhuǎn)移到多核糖體中.干種子中蛋白質(zhì)翻譯整體水平應(yīng)處于較低的狀態(tài)，浸泡一定時(shí)間后蛋白質(zhì)翻譯水平迅速提高.為研究多核糖體特征圖譜是否能體現(xiàn)這種mRNA定位的變化，利用蔗糖密度梯度超速離心法對(duì)浸泡不同時(shí)間大豆胚根細(xì)胞的核糖體特征圖譜進(jìn)行分析.圖6顯示，干種子中多聚核糖體特征曲線(xiàn)中多核糖體的峰型很低，這一現(xiàn)象是翻譯水平受到抑制的體現(xiàn)［22］.萌發(fā)4 h后，胚根細(xì)胞中多聚核糖體特征曲線(xiàn)中多核糖體的峰型明顯升高，顯示細(xì)胞內(nèi)翻譯水平的升高.該結(jié)果證實(shí)干種子細(xì)胞中整體翻譯水平受到抑制，細(xì)胞內(nèi)的mRNA處于儲(chǔ)存狀態(tài)，浸泡一定時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)的mRNA處于翻譯狀態(tài)，該結(jié)果與2.5節(jié)的結(jié)果一致.

圖6 大豆胚根在0和4 h萌發(fā)時(shí)的多聚核糖體特征圖譜Fig.6 Polysome profiles of soybean radicles after different hours(0h，4h)of imbibition

2.7 翻譯抑制劑對(duì)大豆胚根萌發(fā)的影響

大豆干種子中除了含有大量的儲(chǔ)存mRNA外，還含有大量的儲(chǔ)存蛋白質(zhì).2.4節(jié)的結(jié)果顯示大豆胚根可以依賴(lài)干種子中儲(chǔ)存的mRNA完成萌發(fā).大豆胚根是否也可以依賴(lài)干種子中儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)完成萌發(fā)?為探明這一問(wèn)題，本研究檢測(cè)分析了在翻譯被抑制的條件下大豆胚根的萌發(fā)情況.以浸泡在水中的大豆胚根為對(duì)照組，以浸泡在翻譯抑制劑100 μg/mL翻譯抑制劑CHX溶液的大豆胚根為se處理組，為區(qū)分大豆胚根的伸長(zhǎng)是萌發(fā)結(jié)果還是吸水膨脹的結(jié)果，用沸水浴處理后的大豆胚根浸泡在水中作為sbt處理組.然后觀(guān)察不同處理?xiàng)l件下大豆胚根的萌發(fā)情況.圖7結(jié)果顯示，大豆干種子胚根長(zhǎng)為4.3 mm，經(jīng)沸水煮過(guò)后sbt處理組胚根伸長(zhǎng)至6.4 mm;浸泡4 h后，對(duì)照組胚根伸長(zhǎng)至7.3 mm，se處理組胚根伸長(zhǎng)至與sbt處理組相同的長(zhǎng)度后不再伸長(zhǎng);浸泡8 h后，對(duì)照組胚根伸長(zhǎng)至8 mm，而se處理組和sbt處理組胚根長(zhǎng)度依然沒(méi)有變化.之后，隨著萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組胚根繼續(xù)伸長(zhǎng)，而se和sbt處理組胚根長(zhǎng)度不再變化.雖然se處理組的胚根伸長(zhǎng)，但與已經(jīng)致死的sbt處理組相比，長(zhǎng)度無(wú)區(qū)別，說(shuō)明這種伸長(zhǎng)是因單純吸水膨脹引起的，并沒(méi)有發(fā)生由于胚細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的伸長(zhǎng).表明大豆胚根在翻譯被抑制的條件下不能完成萌發(fā)過(guò)程.大豆胚根的萌發(fā)需要有新蛋白質(zhì)的合成，轉(zhuǎn)錄被抑制的情況下，儲(chǔ)存的mRNA能繼續(xù)為新蛋白質(zhì)合成提供模板，使種子完成萌發(fā).

圖7 翻譯抑制劑處理對(duì)大豆胚根萌發(fā)的影響Fig.7 The effects of translation inhibitor on the germination of soybean radicle

結(jié) 語(yǔ)

本研究通過(guò)抑制mRNA和蛋白質(zhì)的合成，了解儲(chǔ)存mRNA和儲(chǔ)存蛋白質(zhì)在大豆胚根萌發(fā)過(guò)程所起的作用.發(fā)現(xiàn)大豆胚根中儲(chǔ)存mRNA可以為胚根萌發(fā)過(guò)程蛋白質(zhì)的翻譯提供模板，使胚根在沒(méi)有新合成的mRNA的條件下完成萌發(fā).但在沒(méi)有新蛋白質(zhì)合成的情況下，胚根不能依賴(lài)儲(chǔ)存蛋白質(zhì)完成萌發(fā).本研究還發(fā)現(xiàn)大豆胚根中的mRNA可以通過(guò)在多核糖體和mRNA儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)間的運(yùn)動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯.干種子中mRNA主要以?xún)?chǔ)存狀態(tài)存在于多核糖體外的儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)中，吸水后，mRNA主要以翻譯狀態(tài)存在于多核糖體中.該研究為深入了解種子萌發(fā)的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).關(guān)于儲(chǔ)存mRNA在種子萌發(fā)過(guò)程的作用有很多問(wèn)題尚待深入研究.如其他種子，特別是萌發(fā)所需時(shí)間較長(zhǎng)的種子是否也能依賴(lài)儲(chǔ)存mRNA完成萌發(fā)?儲(chǔ)存mRNA在發(fā)育過(guò)程中通過(guò)什么機(jī)制進(jìn)入儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)中?萌發(fā)過(guò)程又是通過(guò)什么機(jī)制轉(zhuǎn)移到多核糖體中?發(fā)育過(guò)程中種子根據(jù)什么機(jī)制選擇哪些mRNA儲(chǔ)存起來(lái)?接下來(lái)我們將對(duì)這些問(wèn)題逐一開(kāi)展研究.

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