朱詩(shī)白，丁文超，劉瑞敏 ，孫伊儻，劉明鎖，唐一鳴，李 濤，姬新穎，馬遠(yuǎn)方，白慧玲

（河南大學(xué) 免疫學(xué)研究所，細(xì)胞與分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封475004）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是隨著人的年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)的血管免疫性炎癥疾?。?］。與此關(guān)聯(lián)的冠心病在國(guó)內(nèi)平均患病率為6.49%，據(jù)此我國(guó)有2 000萬(wàn)冠心病患者，對(duì)家庭和國(guó)家造成非常巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。冠狀動(dòng)脈近側(cè)段之所以好發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化是由于它比所有器官的動(dòng)脈都靠近心室，因而承受最大的收縮壓撞擊。這些部位的血流動(dòng)力學(xué)比較特殊，很可能影響局部血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)。因此加強(qiáng)血液動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)和內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)關(guān)系的研究，對(duì)冠心病的防治具有十分重要的意義［2］。為探討動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的分子機(jī)制，我們總結(jié)了50種與動(dòng)脈硬化的發(fā)生密切有關(guān)基因，見表2。我們初步檢測(cè)了人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的多種基因的表達(dá)，比較其表達(dá)差異，檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有4種基因在人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)明顯差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株HCAEC及人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株HAEC（美國(guó)ScienCell）及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM（美國(guó)ScienCell），購(gòu)至上海復(fù)蒙生物科技有限公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀RG 6000型（澳大利亞Corbett公司），TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），Sybr green PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)公司），引物合成（北京金唯智公司）。紫外分光光度儀（Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HCAEC及 HAEC，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度3×106／mL，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清 RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco公司）培養(yǎng)，接種于24孔培養(yǎng)板，24h后換用低血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM培養(yǎng)液24h，換液后即可用于實(shí)驗(yàn)。倒置顯微鏡下細(xì)胞呈單層鵝卵石狀生長(zhǎng)，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力大于97%。

1.2.2 總RNA提取和cDNA的獲取 使用TRIzol提取人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞總RNA（具體按試劑說(shuō)明操作），以DEPC水溶解。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作將獲得的mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 半定量RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá)量 將獲得的HCAEC及HAEC cDNA稀釋至100ng／μl，以β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)體系和條件按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用于4種基因RT-PCR的引物序列，見表1。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物10μL進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在UV-254紫外透射反射分析儀上觀察結(jié)果，并用數(shù)碼凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并攝像，照片進(jìn)行圖像分析。

表1 用于基因RT-PCR的引物序列

2 結(jié)果

2.1 5種基因在人主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示可見 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1、ICAM2的mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物片段分別位于相當(dāng)與 Mr200bp、260bp、200bp、200bp、100bp的位置，與預(yù)期理論值大小一致（圖1），產(chǎn)物特異，條帶清晰。

2.2 5種基因在人主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)差異

根據(jù)我們的前期研究工作基礎(chǔ)，以及文獻(xiàn)檢索結(jié)果，我們初步判斷出50種與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)的基因（表2），有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而我們檢測(cè)的4種基因（VEGF、COX-2、ENOS、ZO-1）正是表中總結(jié)的抗動(dòng)脈粥樣硬化基因（＋表示），4種基因的表達(dá)特點(diǎn)是在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平均高于人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，而ICAM2是表2中顯示動(dòng)脈粥樣硬化基因，特點(diǎn)是在冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)高于主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（圖1）。

圖1 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1、ICAM2在人主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)注：A-HAEC；B-HAC；1-VEGF；2-COX-2；3-eNOS；4-ZO-1；5-ICAM2

表2 我們研究的50種基因在AS中的作用，檢索分析結(jié)果

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病。在粥樣斑塊中存在許多免疫細(xì)胞，而且在不穩(wěn)定斑塊中尤為豐富。近年來(lái)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中免疫細(xì)胞的聚集、分化和激活有了更深入的了解［3］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了多種與其相關(guān)的病毒和細(xì)菌感染。通過研究初步確定了幾個(gè)自身性抗原，并提出了自身免疫假說(shuō)。根據(jù)這些新的認(rèn)識(shí)，提出了免疫調(diào)節(jié)和預(yù)防接種等心血管疾病的新的預(yù)防和治療策略［4］。這必將極大地提高對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的研究和防治水平。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制中，免疫學(xué)說(shuō)越來(lái)越引起人們的重視。研究［5－6］發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞在粥樣硬化斑塊中聚集，說(shuō)明免疫在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中也起作用。加強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化免疫機(jī)制的研究，確定動(dòng)脈粥樣硬化的免疫學(xué)性質(zhì)，尤其探索天然免疫在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生早期的作用，有助于徹底闡明動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制。

動(dòng)脈粥樣硬化最早的改變?yōu)檠軆?nèi)皮細(xì)胞功能異常［7］。作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的力有2種：流體對(duì)管壁的剪應(yīng)力（wall shear stress，WSS）和固體周圍牽張力（circumferential strain，CS），前者是由血流驅(qū)動(dòng)的，血管長(zhǎng)軸平行；而后者則是由血壓驅(qū)動(dòng)引起的，是垂直于血管壁的環(huán)形張力，作用于血管壁所有細(xì)胞。這2種力同時(shí)作用于襯于血管的內(nèi)皮細(xì)胞，從而可以調(diào)節(jié)其表型。在動(dòng)脈粥樣硬化最顯著的循環(huán)部位如冠狀動(dòng)脈，CS和 WSS是非常不同步的［8］。故認(rèn)為血液動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)［9］。相對(duì)于冠狀動(dòng)脈，主動(dòng)脈為不易發(fā)生粥樣硬化的部位，為了探討主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈的血液動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)對(duì)粥樣硬化形成的影響，我們選擇檢測(cè)5種與免疫學(xué)相關(guān)的基因并比較在主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，四種基因 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1均為我們?cè)诔醪窖芯拷Y(jié)果的基礎(chǔ)上經(jīng)過檢索確定的可能為抗動(dòng)脈粥樣硬化的基因，而我們的檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了我們的推測(cè)，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞較冠狀動(dòng)脈更易表達(dá) VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1。而ICAM2為動(dòng)脈粥樣硬化基因，冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞較主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)ICAM2，可能使其易發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。

表2中基因的作用是根據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果，我們課題組初步確定的，共有“動(dòng)脈粥樣硬化易感基因”21種（－表示），“動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)基因”27種（＋表示），另有兩種基因APOA與APOB作用尚無(wú)確定。我們檢測(cè)只是我們的初步驗(yàn)證，根據(jù)我們的前期研究，我們推測(cè)在不同的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有不同的特異基因的表達(dá)，在冠狀動(dòng)脈等動(dòng)脈粥樣硬化好發(fā)部位，由于血液動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)WSS和CS不同步性高，使得兩類基因的表達(dá)失衡，基因表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化性特點(diǎn)；而在主動(dòng)脈等動(dòng)脈粥樣硬化非好發(fā)部位，WSS和CS同步性較好，其基因表達(dá)呈現(xiàn)抗動(dòng)脈粥樣硬化性特點(diǎn)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)檢索結(jié)果［10］我們認(rèn)為正常情況下，動(dòng)脈保護(hù)性基因與動(dòng)脈粥樣硬化性基因處于平衡狀態(tài)，而在動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)，平衡易被打破，造成動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病，該假設(shè)我們將進(jìn)一步通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)并修改。

［1］Caro C G.Discovery of the role of wall shear in atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29（2）：158－161.

［2］Fleming I.Molecular mechanisms underlying the activation of eNOS［J］.Pflugers Arch，2010，459（6）：793－806.

［3］陳衛(wèi)軍、應(yīng)大君.血流切應(yīng)力影響動(dòng)脈內(nèi)皮形態(tài)重建的在體研究［J］.解剖學(xué)報(bào)，2002，33（3）：274－276.

［4］Qiu Y，Tarbell J M.Numerical simulation of pulsatile flow in a compliant curved tube model of a coronary artery［J］.J Biomech Eng，2000，122（1）：77－85.

［5］Dancu M B，Tarbell J M.Large Negative Stress Phase Angle（SPA）attenuates nitric oxide production in bovine aortic endothelial cells［J］.J Biomech Eng，2006，128（3）：329－334.

［6］Dancu M B，Tarbell J M.Coronary endothelium expresses a pathologic gene pattern compared to aortic endothelium：correlation of asynchronous hemodynamics and pathology in vivo［J］.Atherosclerosis，2007，192（1）：9－14.

［7］.Berardi D E，Tarbell J M.Stretch and Shear Interactions Affect Intercellular Junction Protein Expression and Turnover in Endothelial Cells ［J］.Cell Mol Bioeng，2009，2（3）：320－331.

［8］Shi Z D，Ji X Y，Berardi DE，et al.Interstitial flow induces MMP-1expression and vascular SMC migration in collagen I gels via an ERK1／2-dependent and c-Jun-mediated mechanism［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298（1）：H127－135.

［9］Alenghat F J，Ingber D E.Mechanotransduction：all signals point to cytoskeleton，matrix，and integrins［J］.Sci STKE，2002（119）：6.

［10］姬新穎、李濤、劉瑞敏，等.血流動(dòng)力學(xué)新特點(diǎn)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)系［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，30（4），231－237.