趙 貝，李鴻儒，杜鋼軍，劉偉杰，王瑩瑩，李佳桓

（河南大學藥學院 藥物研究所，河南 開封475004）

中藥可作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，其抗腫瘤活性已得到國際公認，為近年來研究的熱點［1］。阿魏是我國人民長期應用的中藥之一，早在《新修本草》中就有記載［2］。阿魏有特殊的臭氣，味苦而辛，有理氣消腫、活血消疲、祛痰和興奮神經(jīng)的功效［3－4］。近年來，由于發(fā)現(xiàn)其中具有植物雌激素活性成分和抗癌物質(zhì)而備受人們關注。我們實驗的目的是在整體、細胞、分子三個水平上探究阿魏藥酒的抗腫瘤活性，以期為臨床抗腫瘤應用提供指導。

1 材料

1.1 藥品與試劑

阿魏（購自開封市天濟大藥房，經(jīng)河南大學中藥研究室鑒定為真品）；阿魏藥酒（取阿魏、黃酒以10∶100的比例浸泡1周，紗布過濾，供動物實驗使用，無菌過濾濾液供細胞實驗使用）；CAT測定試劑盒、T-SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Col-I測定試劑盒（進口分裝）。

1.2 動物及瘤株

昆明小鼠，雌性，20～26g，河南省醫(yī)學實驗動物中心提供（合格證號：豫動合字101號）；H22肝癌，本實驗室于昆明小鼠在體傳代保存；4T1乳腺癌，BALB／c小鼠在體傳代保存。

1.3 儀器

HDL潔凈臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；ElX 800UV型酶標儀（美國 Bio-Tek公司）；TDL-50B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；LDZX-75KBS立式壓力蒸氣滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；LGR16-W高速冷凍離心機（北京京立離心機有限公司）；電子天平FA 1004N（上海精密儀器有限公司）；XDS-500D倒置顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）；DYY-7C電泳儀。

2 方法

2.1 對H22小鼠肝癌皮下移植腫瘤的影響

將接種10d左右生長良好的H22小鼠腹水稀釋成5×106個細胞／mL，以0.2mL／只接種于20只雌性昆明小鼠右腋部皮下，建立H22肝癌皮下移植對照。接種后將小鼠按體質(zhì)量分為2組，每組10只。對照組：灌胃黃酒；阿魏組：灌胃質(zhì)量分數(shù)為10%的阿魏藥酒。實驗當天開始以0.2mL／10g給藥，1次／d監(jiān)測小鼠體質(zhì)量，給藥2次，給藥間隔為8h，連續(xù)25d。腫瘤長出后開始用游標卡尺隔天測腫瘤直徑2次，計算瘤體積。實驗25d眶靜脈取血分離血清用于檢測Col-I、T-SOD、CAT，然后處死小鼠，剝離腋部腫瘤、脾臟、胸腺、肝臟并稱重，按文獻［5］方法計算腫瘤抑制率及臟器指數(shù)。

Col-I、T-SOD、CAT檢測按試劑盒說明進行，抑瘤率、臟器指數(shù)按文獻［5］方法進行。

腫瘤體積（cm3）＝ 腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度／2；抑瘤率（%）＝（正常對照組瘤質(zhì)量均值－用藥組瘤質(zhì)量均值）／正常對照組瘤質(zhì)量均值×100%；臟器指數(shù)%＝臟器體質(zhì)量／處死當日體質(zhì)量×100%。

2.2 對血清中過氧化氫酶、肌酸激酶、總超氧化物歧化酶活性的影響

2.2.1 過氧化氫酶測定 過氧化氫酶（CAT）分解過氧化氫的反應可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的過氧化氫與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡藍色的絡合物，在405nm處測定其生成量，可計算出CAT的活力。

血清中CAT活力（U／mL）＝（對照管OD 值－測定管OD 值）×271×1／（60×取樣量20μL）×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

2.2.2 總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的測定通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見分光光度計測其吸光度。當被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。

總SOD活力（U／mL）＝（對照管吸光度－測定管吸光度）／對照管吸光度／50%×反應體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

2.2.3 I型膠原酶聯(lián)免疫檢測 采用ELISA試劑盒測定樣品中小鼠I型膠原（Col I）的水平。向預先包被了小鼠I型膠原單抗的酶標孔中加入Col I，37℃溫箱中溫育30min，洗滌后，加入HRP標記過的Col I抗體。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色顯色，10min后加入終止液，于450nm處測其吸光度，根據(jù)回歸方程計算樣品濃度。

2.3 對腫瘤細胞增殖的影響

將4T1小鼠乳腺癌傳代細胞用胰酶-EDTA（2∶1）消化液消化，將消化后的細胞用含體積分數(shù)為10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度，吹打成單細胞懸液接種于96孔板，100μL／孔，補充不同濃度阿魏的同樣培養(yǎng)基100μL／孔，每孔4個復孔。阿魏的終濃度設為0、0.5、0.25、0.125g／L。設置于體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃條件下培養(yǎng)48h后，棄去藥物，加入5g／L的 MTT 100μL／孔，放置4h后甩出 MTT，加入DMSO 100μL／孔，混勻后于酶標儀570nm處測吸光度A，計算抑制率［6］。

抑制率（%）＝1－加藥組OD值／不加藥物組OD值 ×100%。

2.4 對淋巴細胞增殖的影響

取2只昆明小鼠處死，無菌分離脾臟，用D-Hanks緩沖液研磨脾臟，Tris-NH4CL裂解紅細胞提取出脾淋巴細胞，用含體積分數(shù)為10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液稀釋，吹打混勻成單細胞懸液。接種于48孔培養(yǎng)板內(nèi)的6孔作無ConA的對照組，250μL／孔。在細胞懸液中加入0.2g／L ConA 1.42mL，充分混勻后接種于剩余孔內(nèi)，250μL／孔，補充不同濃度阿魏的同樣培養(yǎng)基250μL／孔，每孔3個復孔。阿魏的終濃度設為0、0.5、0.25、0.125g／L。置于體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃條件下培養(yǎng)48h，吸去上清液，每孔加入MTT 250μL，培養(yǎng)4h后用移液器吸出MTT，加入DMSO 250μL／孔，轉(zhuǎn)入96孔板，混勻后于酶標儀570nm測吸光度A。

2.5 對基質(zhì)金屬酶活性的影響

將模具準備安裝好后制備灌注分離膠和濃縮膠，待膠凝固后置入電泳槽中，加入電泳緩沖液，取動物實驗瘤組織提蛋白，用樣品處理液處理后以20μL／孔加樣。濃縮時80V，到分離膠時可加大至100V，至溴酚藍指示劑遷移至下緣時停止電泳。將膠剝離至含0.39mmol／L Triton X-100，50mmoL／L Tris -HCL，5mmoL／L CaCl2的洗脫液中振蕩洗脫2次，每次1h，再用漂洗液（除不含Triton X-100外，其余同洗脫液）漂洗2次，20min／次，隨即將凝膠置于孵育液中37℃孵育12～16h。孵育結(jié)束后經(jīng)染色液染色4h，倒掉染色劑，清水沖洗，倒入脫色液脫色2～3次至藍色背景和白色條帶清晰為止，結(jié)果顯示，MMP-2（72KDa）和MMP-9（92KDa）為位于藍色背景上的透亮帶。

2.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，2組間差異性比較采用t檢驗。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 對H22肝癌小鼠體質(zhì)量、腫瘤及免疫器官的影響

與對照組相比，給藥后小鼠體質(zhì)量下降并不明顯，給藥期間小鼠狀態(tài)良好，見圖1；阿魏組瘤體積與對照組比較，P＞0.05，無顯著性差異，但腫瘤生長速度比對照組緩慢，抑瘤率為12.8%，見圖2；肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均下降，脾臟指數(shù)有所升高，但均無顯著性差異，見表1。

3.2 對荷瘤小鼠體內(nèi)抗氧化酶及I型膠原的影響

與對照組比較，給藥后小鼠血清中的Col-I表達有特別顯著性增強（P＜0.01），抗氧化酶活力均有所增強，其中T-SOD的活力有顯著性增強（P＜0.05），見表2。

圖1 小鼠體質(zhì)量生長曲線

圖2 小鼠瘤體積生長曲線

表1 對荷瘤小鼠腫瘤及臟器的影響（ˉx±s，n＝10）

表2 對荷瘤小鼠血清中酶的影響（ˉx±s，n＝10）

3.3 對小鼠脾淋巴細胞和4T1乳腺癌細胞的影響

不同濃度的阿魏對小鼠脾淋巴細胞增殖有不同影響，當阿魏濃度為0.25g／L時對淋巴細胞增殖影響最大，見表3。實驗各濃度對4T1小鼠乳腺癌細胞生長均無抑制作用，見表4。

表3 對淋巴細胞增殖的影響

表4 對4T1小鼠乳腺癌細胞的影響

3.4 對基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

與對照組相比，72kDa的MMP-2亮度較暗，且面積約為對照組的50%；92kDa的 MMP-9面積與對照組基本相同，但亮度稍低，見圖3。

圖3 基質(zhì)金屬蛋白酶比較

4 討論

我們從整體、細胞、分子三個水平進行了阿魏藥酒的抗腫瘤活性研究。實驗中，阿魏藥酒對H22肝癌皮下腫瘤抑瘤效果不明顯，抑瘤率僅為12.8%，但小鼠生長狀態(tài)較好，臟器指數(shù)均無顯著性差異。考慮到本次實驗腫瘤接種時瘤株生長較快的特點，結(jié)合阿魏在傳統(tǒng)中藥中只是一個化痞散結(jié)藥物，阿魏的抗腫瘤作用可能不是直接的，這可以從細胞試驗中阿魏藥酒對腫瘤細胞的抑制率均為負值，不僅沒有抑制作用，反而表現(xiàn)出促進趨勢中得到驗證。

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移發(fā)生的最關鍵一步是對細胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜（BM）的降解。Col-I是細胞外基質(zhì)主要成分，大量表達的I型膠原對于腫瘤的轉(zhuǎn)移是抑制的［7］。瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與其誘導產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）降解ECM、BM的能力密切相關，其在許多腫瘤中呈高表達［8］。阿魏組Col-I表達顯著增多，且在電泳實驗中MMP-2條帶面積明顯小于對照組，MMP-9條帶亮度較對照組暗，提示阿魏藥酒對腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移有阻止作用。

目前的研究證實，氧自由基水平的增高以及細胞抗氧化酶活性的改變可以導致腫瘤的發(fā)生，而腫瘤患者通常也表現(xiàn)出機體氧化還原狀態(tài)的失衡。實驗中對血清抗氧化酶活性的測定顯示，阿魏藥酒對抗氧化酶活性有影響，給藥組小鼠T-SOD、CAT活力均比對照組高。雖CAT無顯著性差異，但仍有增高趨勢，對TSOD則有顯著性影響。說明阿魏藥酒具有一定抗氧化能力，可能與阻止腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移有一定關系。

綜上所述，阿魏藥酒對腫瘤的直接抑制作用弱，但可阻止腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，一定濃度能提高機體免疫能力，有抗氧化作用。體現(xiàn)了消痞散結(jié)中藥的特點，如與其他抗腫瘤中藥聯(lián)合使用可能更為合理。

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