超聲提取/氣相色譜－質(zhì)譜法測定海洋生物中的多環(huán)芳烴

孫閏霞，柯常亮，林 欽*，石鳳瓊

(1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300;2.上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中具有兩個或兩個以上苯環(huán)的持久性有機污染物，主要來源于煤、石油等礦物燃料和其他有機物質(zhì)的不完全燃燒和熱解［1－3］。大部分PAHs對生物都有不利影響，如免疫毒性、致癌、致畸、致突變效應等，還被證實具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的作用［4－5］。海洋環(huán)境中的PAHs主要來自石油泄漏、污水排放、大氣沉降以及地表徑流等途徑［6］。這些污染物很容易在魚、貝類等海洋生物體中蓄積，并最終通過食物鏈影響人類健康。一般人群(不包括吸煙者和職業(yè)暴露人群)PAHs飲食攝入量占其總暴露量的90%以上［7］;魚類等海產(chǎn)品雖只占人類飲食的10%左右，卻是這些污染物進入人體的重要途徑［8］。近年來，隨著海洋污染的加劇，海洋生物體中PAHs的監(jiān)測越來越引起人們的重視，它不僅能反映水體的實時污染狀況，還與人類健康密切相關。

目前，PAHs的測定方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜－質(zhì)譜法(GC－MS)等。其中，GC－MS由于其選擇離子(SIM)技術在復雜基質(zhì)和多組分分析上的優(yōu)勢而得到較為廣泛的應用。研究對象大多集中于大氣、土壤、沉積物和水體等環(huán)境樣品［9－13］，而對生物體中PAHs殘留分析的研究相對較少。對于已有的分析方法，前處理主要為索氏提取或皂化后有機溶劑萃取等。國家水產(chǎn)行業(yè)標準SC/T 3042－2008采用皂化后有機溶劑萃取GC－MS法測定水產(chǎn)品中16種PAHs，但該方法不僅凈化步驟繁瑣，有機溶劑消耗多，而且取樣量大(50 g濕樣)。與常見水產(chǎn)經(jīng)濟種類相比，海洋野生生物樣品的采集存在一定困難，樣品量也常受限制，通常無法直接采用該方法進行測定。索氏提取是一種經(jīng)典的固體樣品提取方法，因其理想的回收率而被大量用于海洋生物樣品PAHs的分析中，但該方法耗時較長(約20 h)，不適合大批量樣品的處理［14－16］。因此，快速、高效、便捷的樣品前處理方法成為海洋生物樣品中PAHs分析的迫切需要。目前已有一些學者在魚類、貝類、蟹類等生物樣品中PAHs的分析上嘗試采用微波輔助提?。?7］、加速溶劑萃?。?8－19］、超臨界流體提?。?0］、基質(zhì)固相分散萃?。?1－22］、分散固相萃?。?3］等新型樣品提取方法。

超聲提取法是一種高效、快速、簡單的有機污染物萃取技術，已被廣泛用于土壤和沉積物樣品中PAHs的分析［11，24－25］，而對魚類等生物樣品的相關研究卻鮮有報道，僅有少量針對貝類組織的簡單研究［24，26－27］。與微波輔助提取、加速溶劑提取和超臨界流體提取等方法相比，超聲提取在常溫、常壓下進行，免去了高溫、高壓對某些目標成分的影響，便于實現(xiàn)，成本較低［24］。同時，超聲波能增加溶劑的穿透力從而進入細胞內(nèi)部，相較于分散固相萃取等簡單的有機溶劑提取，超聲提取法對于實際樣品中PAHs的分析更有優(yōu)勢。本文選取魚類、蝦類、貝類和蟹類等常見海洋生物種類為測定對象，建立了超聲提取/氣相色譜－質(zhì)譜法快速測定海洋生物體中16種美國環(huán)保局(USEPA)優(yōu)先控制的PAHs的分析方法，對樣品提取、凈化和色譜質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化，并將該方法成功應用于實際樣品中PAHs的分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890A－5975C氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);Laborota 4000型旋轉蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司);DL6000B低速冷凍離心機(中國安亭科學儀器廠);KQ5200DA型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XW－80A漩渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司);玻璃層析柱(200 mm×10 mm i.d.)。

16種PAHs混合標準樣品和內(nèi)標苊-D10，菲-D10，-D12，苝-D12(美國Supelco公司)，均以正己烷為溶劑配制成質(zhì)量濃度為200 mg/L的標準儲備液，4℃密封避光保存;二氯甲烷、正己烷(色譜純，Tedia公司);硫酸(優(yōu)級純);無水硫酸鈉(分析純，廣州化學試劑公司):使用前600℃烘干4 h，冷卻后于干燥器中保存;中性氧化鋁(層析純，200～300目):400℃烘4 h，冷卻后加4%純水活化，于干燥器中保存;硅鎂型吸附劑(弗羅里硅土，層析純，60～100目):130℃烘12 h，冷卻后于干燥器中保存;硅膠(層析純，100～200目):140℃烘4 h，冷卻后于干燥器中保存。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱:HP-5MS石英毛細管柱(30.0 m×250.0 μm i.d.×0.25 μm);進樣口溫度:290℃;程序升溫:柱初始溫50℃，保持1 min，再以20℃·min－1升至100℃，然后以10℃·min－1升至210℃，保持1 min，最后以5℃·min－1升至290℃，保持5 min;載氣:氦氣，流速1.3 mL·min－1;進樣方式:脈沖不分流進樣;進樣量:1 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源模式(EI)，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，四極桿溫度150℃，電子轟擊能量70 eV，選擇離子監(jiān)測(SIM)方式，16種PAHs的保留時間、特征離子和定量離子以及相應的內(nèi)標物見表1。

表1 16種多環(huán)芳烴的保留時間、定性和定量離子、內(nèi)標物、線性方程、相關系數(shù)及檢出限Table 1 Retention times，qualitative ions，quantitative ions，internal standards，linear equations，correlation coefficients(r)and detection limits(LODs)of 16 PAHs

1.3 實驗方法

將海洋生物樣品(帶魚、沙丁魚、竹莢魚、海鰻、大黃魚、牡蠣、梭子蟹、蝦姑、對蝦等)用海水清洗，取肌肉組織勻漿。稱取已制成均勻肉糜的樣品5.00 g，加入5.0 g無水硫酸鈉研磨均勻后將樣品置于50 mL具塞離心管中，加入100 μL 1 mg/L內(nèi)標使用液和20 mL環(huán)己烷－二氯甲烷(2∶1)溶液，漩渦混合后超聲萃取30 min，以4 800 r/min離心3 min，將上清液轉移至100 mL雞心瓶內(nèi)。重復超聲萃取1次，合并上清液，于旋轉蒸發(fā)儀上40℃濃縮至近干。用4 mL正己烷分2次清洗雞心瓶并轉移至離心管中，用適量60%的硫酸溶液清洗提取液數(shù)次至硫酸層無色。5 500 r/min離心5 min，取有機相緩慢加入層析柱上。采用正己烷濕法裝柱，層析柱從上到下依次為3 cm無水硫酸鈉、3 cm中性氧化鋁、3 cm弗羅里硅土。先用5 mL正己烷淋洗棄去，然后用40 mL正己烷－二氯甲烷(4∶1)洗脫，收集洗脫液，于旋轉蒸發(fā)儀上40℃濃縮至近干。用正己烷定容至1 mL，轉移至棕色進樣瓶中，待測。

2 結果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗發(fā)現(xiàn)進樣方式、進樣口溫度、柱溫、載氣流速、離子源溫度等對PAHs各組分的保留時間和分離度有很大影響。PAHs中的高沸點組分不易氣化，通過將進樣口溫度由260℃升至290℃不僅可提高其響應值還可降低進樣口污染。脈沖不分流進樣促使樣品快速從進樣口進入色譜柱，減少了樣品在進樣口分解的同時提高了方法的靈敏度。選擇性降低程序升溫速率有利于菲和蒽、苯并［a］蒽和 以及苯并［b］熒蒽、苯并［k］熒蒽和苯并［a］芘等同分異構體的分離，合適的載氣流速可節(jié)約樣品分析時間，并提高分離效率和改善峰形。在無雜質(zhì)干擾的情況下，選擇基峰和豐度較高的碎片離子采用選擇離子監(jiān)測模式(SIM)分時段分組監(jiān)測，提高了方法靈敏度。以樣品的色譜保留時間和質(zhì)譜特征離子及其相對豐度進行定性，以保證方法的準確性。優(yōu)化后的色譜質(zhì)譜條件見“1.2”。在優(yōu)化條件下，100 μg/L的16種PAHs及內(nèi)標物混合標準溶液和20 μg/kg加標水平下魚肉樣品的選擇離子色譜圖見圖1。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑種類的選擇 通常用于提取生物樣品中PAHs的溶劑有正己烷、二氯甲烷、丙酮、苯及其混合溶液［17，19，23，27］。為了達到提取效率最大化、提取液中干擾物質(zhì)最小化以及綠色環(huán)保的目的，比較了3種不同體積比的正己烷－二氯甲烷混合溶劑(4∶1，2∶1，1∶1)對樣品中PAHs的提取效果(見圖2)。由圖2可知，4∶1正己烷－二氯甲烷對萘、苊烯等2～3環(huán)PAHs的提取效果較好，但同時提取出的脂肪及其他雜質(zhì)成分較多。正己烷－二氯甲烷(1 ∶1)對茚并［1，2，3-cd］芘、二苯并［a，h］蒽等5～6環(huán)PAHs提取有優(yōu)勢，干擾物質(zhì)較少，但對2～4環(huán)PAHs的回收率相對較差。溶劑提取能力的大小取決于溶劑消弱目標物和基體間作用力的能力以及溶質(zhì)在提取溶劑中的溶解度。正己烷－二氯甲烷混合溶液的極性隨著二氯甲烷比例的升高而增加，而PAHs中高環(huán)組分具有一定極性，根據(jù)相似相溶原理，增大溶劑中的二氯甲烷比例，可更容易提取極性較大的高環(huán)組分。由于體積比為2∶1時正己烷－二氯甲烷溶液對16種PAHs的平均回收率均較理想(回收率為74%～113%)，因此本實驗最終選擇正己烷－二氯甲烷(2∶1)為最佳提取溶劑，用于后續(xù)海洋生物樣品中PAHs回收率的研究。

圖2 不同比例正己烷－二氯甲烷混合溶劑(4∶1，2∶1，1∶1)對樣品中PAHs的提取效果Fig.2 Effect of different ratio of n-hexane to dichloromethane on extraction recoveries of PAHs in fish tissues sample

2.2.2 提取溶劑用量的選擇 以正己烷－二氯甲烷(2∶1)溶液為提取試劑，考察了不同提取體積對提取效果的影響。分別使用15、20、30 mL正己烷－二氯甲烷(2∶1)對每個試樣重復提取2次，按照本方法進行凈化和測定。結果表明，提取溶劑用量為15 mL時，16種PAHs的提取效率較低;而用量為20 mL和30 mL時，16種PAHs的提取效率接近，其回收率分別為74%～105%和71%～112%。因此，實驗選擇提取溶劑的最佳用量為20 mL。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

2.3.1 凈化方法的選擇 生物樣品的凈化有利于提高方法的檢出限并延長儀器使用壽命。脂類物質(zhì)是生物樣品中PAHs分析的主要干擾物質(zhì)，濃硫酸對脂肪具有很好的去除作用，但會造成PAHs多種組分不同程度的損失［19］。根據(jù)前期研究［19－20，23，28］，本研究實驗了多種凈化方案，如基質(zhì)固相分散、60%硫酸處理和層析柱凈化。結果表明，提取液依次經(jīng)60%硫酸和層析柱凈化后，脂肪的去除效果最佳，硫酸用量與脂肪含量有關。隨后，考察了不同層析柱填料對凈化效果的影響。弗羅里硅土、硅膠和中性氧化鋁是生物體PAHs凈化中常用的3種吸附劑，目前已有研究發(fā)現(xiàn)弗羅里硅土和硅膠對魚類組織PAHs提取物具有理想的凈化效果［17］。中性氧化鋁對脂肪具有很好的吸附性，但一般不單獨使用。本實驗考察了弗羅里硅土、硅膠、中性氧化鋁－弗羅里硅土(體積比1∶1)、中性氧化鋁－硅膠(體積比1∶1)4種不同填料層析柱的凈化效果，結果見圖3。由圖可知，硅膠層析柱對樣品中雜質(zhì)的去除效果最差，雜峰較多且峰高較大;其次為中性氧化鋁－硅膠和弗羅里硅土;中性氧化鋁－弗羅里硅土復合層析柱處理后的樣品色譜圖最干凈，雜質(zhì)的去除效果最好。這可能不僅與吸附劑的吸附特性有關，還受吸附劑用量的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，相同體積的填料，硅膠、弗羅里硅土、中性氧化鋁的質(zhì)量依次增加。因此，最終選用中性氧化鋁－弗羅里硅土復合層析柱。

圖3 弗羅里硅土(A)、硅膠(B)、中性氧化鋁－弗羅里硅土(1∶1，C)和中性氧化鋁－硅膠(1∶1，D)4種層析柱凈化后的樣品色譜圖Fig.3 Selective ion monitoring(SIM)chromatograms of the biological samples purified by Florisil(A)，silica gel(B)，neutral aluminum oxide and Florisil(1 ∶1，C)，neutral aluminum oxide and silica gel(1 ∶1，D)

2.3.2 洗脫劑用量的選擇 不同體積比的正己烷－二氯甲烷溶液對PAHs的洗脫效果不同。正己烷比例高，則洗脫液的用量大，而二氯甲烷的比例高，則洗脫雜質(zhì)多［21］。本實驗選定4∶1正己烷－二氯甲烷溶液為洗脫劑，采用PAHs標準溶液分別考察了體積用量分別為30、35、40、50 mL時的洗脫效率。實驗發(fā)現(xiàn)，當洗脫劑用量為30 mL和35 mL時，苯并［a］芘、茚并［1，2，3-cd］芘、二苯并［a，h］蒽、苯并［g，h，i］苝和內(nèi)標苝-D12等部分高環(huán)組分出現(xiàn)色譜峰丟失或峰面積偏低現(xiàn)象，以內(nèi)標物苝-D12進行定量的5環(huán)和6環(huán)PAHs化合物無法定量或回收率范圍波動較大。由于柱層析凈化是根據(jù)物質(zhì)在填料上的吸附力不同而進行分離，中性氧化鋁和弗羅里硅土均為強極性吸附相，對具有一定極性的高環(huán)PAHs組分的吸附性較強，洗脫所需溶劑的用量較大，上述現(xiàn)象說明洗脫劑的用量不足，這些組分未能從層析柱上完全洗脫。當洗脫劑用量為40 mL和50 mL時，16種PAHs組分的回收率接近，分別為90%～103%和88%～103%。從節(jié)約時間和減少溶劑消耗的角度考慮，選用40 mL的4∶1正己烷－二氯甲烷進行洗脫。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

用正己烷配制成16種PAHs質(zhì)量濃度分別為0.005、0.050、0.100、0.200、0.500 mg/L和含內(nèi)標物質(zhì)量濃度為0.100 mg/L的混合標準工作溶液，在上述優(yōu)化色譜條件下進行分析。以目標物與其對應的內(nèi)標物的定量離子峰面積比值為縱坐標，對應的質(zhì)量濃度比為橫坐標進行線性回歸分析。以信噪比(S/N)為3計算檢出限(LOD)。結果表明，16種PAHs在0.005～0.500 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其響應值呈良好的線性關系，相關系數(shù)(r)不低于0.998 4，16種PAHs的檢出限為0.03～0.28 μg/kg。方法的線性方程、相關系數(shù)、檢出限見表1。

2.5 方法的回收率與精密度

選用脂肪含量高的魚肉和蛋白質(zhì)含量高的蝦肉兩種空白基質(zhì)(未檢出，殘留量均小于LOD)分別進行2、20、100 μg/kg 3個加標水平的基質(zhì)加標回收實驗，每一水平分別做6份平行實驗，結果見表2。從表2可知，2 μg/kg加標水平時，樣品中16種PAHs的平均加標回收率為55%～118%;20、100 μg/kg兩個加標水平下的平均加標回收率為79%～114%，相對標準偏差(RSD)均小于10%。

表2 16種PAHs的平均加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Average spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs)of 16 PAHs(n=6)

2.6 實際樣品的測定

采用該方法對來自廣東沿海9種海洋生物體中的16種PAHs進行檢測，結果見表3。從表中可知，實際樣品中有14種PAHs組分被檢出，檢出量為0.43～100.23 μg/kg(濕樣品，下同)。9種水產(chǎn)品中的PAHs總量為64.22～210.57 μg/kg，其中貝類和蟹類等生物樣品中的PAHs組成較為復雜，含量相對較高，這可能與PAHs各組分的理化性質(zhì)、生物的生活習性以及水體中PAHs的污染來源和污染程度等因素有關。通過對比發(fā)現(xiàn)，本研究結果與降升平等［16］采用索氏提取法/GC－MS測定的近海海洋生物中PAHs的殘留量(69.9～390.2 μg/kg)相近;但比楊家鋒等［29］采用SC/T 3042－2008方法和尹怡等［23］采用分散固相萃取/GC－MS測定的部分水產(chǎn)品的殘留量(分別為16.5～38.2 μg/kg和37.1～45.6 μg/kg)略高，這可能與水產(chǎn)品的來源有關。

表3 實際樣品中PAHs含量的測定結果(μg/kg，濕樣品)Table 3 Determination results of PAHs(μg/kg，wet sample)in samples

3 結論

建立了正己烷－二氯甲烷(2∶1)為溶劑超聲輔助萃取，硫酸溶液和氧化鋁－弗羅里硅土復合層析柱凈化，GC－MS測定海洋生物體中16種美國EPA推薦的優(yōu)先控制PAHs的分析方法。結果顯示，16種PAHs在0.005～0.500 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)不低于0.998 4，檢出限為0.03～0.28 μg/kg，回收率除低水平加標時萘為55%外，其余組分均高于60%，精密度和檢出限均優(yōu)于SC/T 3042－2008水產(chǎn)品中PAHs測定方法。該方法簡單快速、準確可靠，取樣量少，大大降低了溶劑消耗，無需特殊設備，成本較低，易于實現(xiàn)，可用于海洋生物體中PAHs含量的檢測。

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