張蓓蓓，章 勇，趙永剛，胡冠九，陳素蘭

(江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心 國家環(huán)境保護(hù)地表水環(huán)境有機(jī)污染物監(jiān)測分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210036)

苯氧羧酸類除草劑是第一類投入商業(yè)生產(chǎn)的選擇性除草劑。苯氧基醇類除草劑主要用作莖葉處理劑，施用于禾谷類作物田、針葉樹林、非耕地、牧草場、草坪等，防除一年生和多年生的闊葉雜草，大多數(shù)闊葉作物，特別是棉花和葡萄等對這類除草劑很敏感。苯氧羧酸類除草劑易溶于水中，因此會(huì)在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中遷移，引起土壤、地下水、大氣等污染。這類除草劑本身有中等毒性，其代謝產(chǎn)物(特別是一些鹵化物)也會(huì)對人類和生物體造成危害，研究表明其可以引起人類軟組織惡性腫瘤，對動(dòng)物體表現(xiàn)出胎盤毒性。經(jīng)其處理過的植物調(diào)亡前會(huì)在體內(nèi)蓄積很高濃度的硝酸鹽或氰化物。同時(shí)因被殺死的有毒雜草和有害植物固有的毒性未改變，因而容易引起動(dòng)物中毒。苯氧羧酸類除草劑對環(huán)境的危害已引起世界各國環(huán)境管理組織的重視。中國《生活飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定2，4-D的濃度限值為0.03 mg/L;世界衛(wèi)生組織(WHO)飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定7種苯氧羧酸類農(nóng)藥的濃度限值在0.002～0.9 mg/L之間;美國聯(lián)邦飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定2，4-D、MCPP的濃度限值分別為0.07 mg/L和0.01 mg/L。

目前，對苯氧羧酸類除草劑多殘留的分析多采用氣相色譜法或氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［1－7］，由于此類化合物極性較強(qiáng)、穩(wěn)定性較差、不易氣化，需衍生后才能測定，整個(gè)操作過程步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且衍生化反應(yīng)容易帶來較多的副產(chǎn)物，干擾目標(biāo)化合物的測定。也有文獻(xiàn)報(bào)道采用毛細(xì)管電泳法［8－9］進(jìn)行苯氧羧酸類的分離測定，由于毛細(xì)管電泳法具有很高的分離度，可實(shí)現(xiàn)對這類農(nóng)藥的手性分離，但靈敏度不高。而采用液相色譜或液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［10－16］測定苯氧羧酸類除草劑多殘留時(shí)，前處理方法相對簡單，無需衍生化，可直接萃取。目前國內(nèi)相關(guān)報(bào)道均是對食品和農(nóng)產(chǎn)品的檢測。本實(shí)驗(yàn)針對環(huán)境水質(zhì)樣品，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，將水樣經(jīng)固相萃取技術(shù)提取濃縮后，采用UPLC－MS/MS法進(jìn)行分離和定量，可在6 min內(nèi)完成8種組分的定性定量分析，實(shí)現(xiàn)樣品的快速檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(Waters Aquity/TQD);Masslynx 4.0工作站;自動(dòng)固相萃取儀(Zymark公司)，HLB固相萃取柱(1 g，Waters公司);氮吹濃縮儀(美國Labconco公司)，0.22 μm混合纖維素酯微孔濾膜、0.22 μm針頭過濾器。

2-甲-4-氯丙酸(MCPP)、2-甲基-4-氯苯氧乙酸(MCPA)、2-甲-4-氯丁酸(MCPB)、2，4-滴丙酸(2，4-DP)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、4-(2，4-二氯苯氧)-丁酸(2，4-DB)、2，4，5-三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)、2，4，5-涕丙酸(2，4，5-TP)、2，4-二氯苯氧乙酸 －13C6(2，4-D －13C6)，純度在98.5%～99.5%之間，質(zhì)量濃度均為100 mg/L，購于Dr.Ehrenstorfer公司，甲醇、乙腈(色譜純，Merck公司)，乙酸銨(色譜純)，純化水(Millipore)。

1.2 色譜分析條件

BEH C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm×1.7 μm);流動(dòng)相為2 mmol/L乙酸銨水溶液(A)和甲醇(B)，采用梯度洗脫模式:0 min，80%A，并保持1 min;3 min時(shí)，60%A;5 min時(shí)，20%A;6 min時(shí)，80%A。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，色譜柱溫為40℃。內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3 質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測。毛細(xì)管電壓2.8 kV，離子源溫度120℃，霧化溫度350℃，霧化氣流速800 L/h，反吹氣流速10 L/h，碰撞氣流速0.10 mL/min，監(jiān)測駐留時(shí)間0.02 s。多反應(yīng)監(jiān)測條件見表1。

表1 目標(biāo)化合物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件Table 1 MS parameters for target pesticides

1.4 樣品制備

活化:用10 mL甲醇活化固相萃取柱，保證小柱柱頭浸潤;再用10 mL去離子水活化小柱，保證小柱柱頭浸潤。上樣:量取500 mL水樣，調(diào)節(jié)水樣pH值至中性，以約10 mL/min的流速將水樣通過小柱，以富集水樣中的苯氧羧酸類化合物。廢水樣品體積可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)減少。淋洗:用10 mL甲醇－水(1∶4)溶液淋洗小柱，將在小柱上保留較弱的雜質(zhì)淋洗下來。吹干:用氮?dú)獯祾咝≈?0 min，將小柱中的殘留水分完全去除。洗脫:用10 mL甲醇洗脫富集后的小柱，并用接收管接收。濃縮:將上述提取溶液濃縮至近干，用去離子水定容至1.0 mL，加入5.0 μL內(nèi)標(biāo)使用液，混勻后過0.22 μm濾膜，置于進(jìn)樣瓶中，等待進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件的選擇

2.1.1 不同固相萃取柱與水樣pH值的比較 比較了C18柱與HLB柱對苯氧羧酸類除草劑的萃取效果，結(jié)果表明HLB柱對8種苯氧羧酸類除草劑均有較好的萃取效果 (74%～90%)，而采用C18柱進(jìn)行萃取時(shí)MCPA和2，4-D的回收率均低于50%。由于苯氧羧酸類化合物具有較強(qiáng)的親水性，而HLB柱填料為親水親脂型聚合物，適合保留親水性物質(zhì)，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

考慮到苯氧羧酸類除草劑屬于弱酸性、極性化合物，采用C18柱進(jìn)行萃取時(shí)，萃取原理為疏溶劑效應(yīng)，為了達(dá)到最佳的萃取效果，需使苯氧羧酸類物質(zhì)在水樣中以分子狀態(tài)存在，故將水樣pH值調(diào)至2.0后上樣分析。結(jié)果表明，該條件下，MCPA和2，4-D的回收率顯著提高，均達(dá)到80%以上，但MCPB和2，4-DB的回收率明顯下降，低于60%。因此采用C18柱萃取時(shí)，無法使得8種苯氧羧酸類除草劑均獲得較高的回收率。

采用HLB柱萃取，水樣調(diào)節(jié)為酸性后上樣與中性上樣相比，部分組分回收率下降明顯。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇HLB柱中性上樣方式。

2.1.2 淋洗液的選擇 考察了不同比例的甲醇－水溶液作為淋洗液對目標(biāo)化合物損失水平的影響。結(jié)果表明，當(dāng)淋洗液中洗脫能力較強(qiáng)的甲醇比例達(dá)到25%時(shí)，MCPA、2，4-D和2，4-DP已有少量損失。最終選擇20%甲醇－水溶液作為淋洗液。

圖1 8種苯氧羧酸類在不同流動(dòng)相下的色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of eight phenoxy acid herbicides at different mobile phases mobile phase:A.acetonitrile－water，B.acetonitrile－2 mmol/L ammonium acetate

2.2 色譜條件的選擇

考察了乙腈－水(圖1A)、乙腈－不同濃度乙酸銨水溶液(1、2、5 mmol/L)等流動(dòng)相對目標(biāo)化合物保留行為的影響，結(jié)果表明當(dāng)采用乙腈－水作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物的峰形較寬并帶有拖尾現(xiàn)象，分離度較差;當(dāng)水相中添加乙酸銨后，目標(biāo)化合物的色譜峰峰形得到極大改善，峰形尖銳而對稱，分離度有所改善。但隨著乙酸銨濃度的提高，對樣品的質(zhì)譜響應(yīng)抑制也相應(yīng)增大，故最終使用2 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相(圖1B)。

同時(shí)還對流動(dòng)相梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，由于8種組分極性十分接近，未能使其色譜峰達(dá)到完全分離，考慮到本實(shí)驗(yàn)使用的是質(zhì)譜檢測器，采用多離子反應(yīng)監(jiān)測模式，故對未達(dá)到基本分離的目標(biāo)化合物也能進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析，不影響分析結(jié)果。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣，對8種苯氧羧酸類除草劑的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。由于苯氧羧酸類除草劑的極性較大，選擇電噴霧離子源，比較正離子和負(fù)離子模式下的掃描結(jié)果，8種目標(biāo)物在負(fù)離子模式下有更好的響應(yīng)，基峰均為［M－H］－，同時(shí)由于苯氧羧酸類物質(zhì)在苯環(huán)上均含有氯原子，故［M+2－H］－峰響應(yīng)較高。

選定［M－H］－為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，尋找子離子碎片。8種化合物的［M－H］－經(jīng)碰撞后產(chǎn)生的碎片很少，大多數(shù)都只有一個(gè)高響應(yīng)碎片(［M－RCOOH］－)，其它碎片的相對豐度均較小，因此本實(shí)驗(yàn)采用同位素離子(即［M+2－H］－)和其產(chǎn)生的二級碎片作為定性離子對。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別配制質(zhì)量濃度為 0.8、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/L的系列苯氧羧酸類除草劑標(biāo)準(zhǔn)工作液，以苯氧羧酸類化合物的質(zhì)量濃度(X，μg/L)對其峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。結(jié)果表明，在該濃度范圍內(nèi)8種組分的相關(guān)系數(shù)均大于0.995。色譜圖如圖2所示。

圖2 8種苯氧羧酸類除草劑和內(nèi)標(biāo)物的總離子流色譜圖(50 μg/L)Fig.2 TIC chromatogram of eight phenoxy acid herbicides standard(50 μg/L)

2.5 精密度與回收率

對兩個(gè)濃度水平分別為0.02、0.20 μg/L的地表水和廢水加標(biāo)樣品進(jìn)行回收率測定，每個(gè)加標(biāo)水平平行配制6份樣品，其加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果見表2。結(jié)果表明:8種農(nóng)藥的回收率為74%～90%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～12.0%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合痕量分析的要求。

表2 8種苯氧羧酸類農(nóng)藥的線性關(guān)系、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear relationships，recoveries and RSDs of eight phenoxy acid herbicides

2.6 檢出限

根據(jù)HJ/T 168－2010空白實(shí)驗(yàn)中未檢出目標(biāo)物質(zhì)的檢出限測定方法，本實(shí)驗(yàn)以4.0 ng/L的水樣濃度作為檢出限測定的濃度，配制7份平行水樣，水樣體積為500 mL。經(jīng)全過程分析，計(jì)算其濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD。以3S為檢出限(LOD)，4倍檢出限為定量下限(LOQ)，結(jié)果見表3。8種農(nóng)藥的檢出限為1.0～1.8 ng/L，方法具有較高的靈敏度，完全滿足水體中農(nóng)殘分析的要求。

表3 方法檢出限計(jì)算結(jié)果(n=7)Table 3 Method detection limits of eight phenoxy acid herbicides(n=7) ρ/(ng·L－1)

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用建立的分析方法，測定了南京地區(qū)長江水中8種苯氧羧酸類農(nóng)藥的含量，結(jié)果均為未檢出，表明該監(jiān)測水域目前未受到苯氧羧酸類農(nóng)藥的污染。

各國對飲用水中苯氧羧酸類的含量限值規(guī)定為0.003～0.9 mg/L，而本方法中水樣經(jīng)過固相萃取富集濃縮后檢出限為1.0～1.8 ng/L，靈敏度非常高，遠(yuǎn)低于限值要求。因此在樣品分析量較大、不追求極高靈敏度時(shí)，可省略富集濃縮過程，水樣經(jīng)pH值調(diào)節(jié)和過濾后直接進(jìn)樣，檢出限亦可達(dá)0.39～0.65 μg/L(根據(jù)HJ/T 168－2010要求測定計(jì)算)，完全滿足監(jiān)測需求，同時(shí)也可提高樣品分析的高通量性。

3 結(jié)論

建立了SPE/UPLC－ESI/MS/MS分析水中苯氧羧酸類除草劑的方法，該法具有操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，且雜質(zhì)干擾少，定性定量準(zhǔn)確可靠，適合于大批量復(fù)雜水樣中苯基羧酸類除草劑的分析。

［1］Wei F，Dong Z L，Yu L.J.Instrum.Anal.(衛(wèi)鋒，董振霖，于玲.分析測試學(xué)報(bào))，2005，24:304－306.

［2］Kuang H，Chu X G，Hou Y X，Qi Y.Chin.J.Food Hyg.(匡華，儲曉剛，侯玉霞，祁彥.中國食品衛(wèi)生雜志)，2006，18(6):503－508.

［3］Xin G B，Tan J Y，Yao L J，Jiang Z L，Zhu Y，Song H.J.Anal.Sci.(辛國斌，譚家鎰，姚麗娟，姜兆林，朱昱，宋輝.分析科學(xué)學(xué)報(bào))，2007，23(4):429－432.

［4］Zhao S C，Dong Z L，Wei F，Jiang J Y，Jiang W F，Xie B.J.Chin.Mass Spectrom.Soc.(趙守成，董振霖，衛(wèi)鋒，蔣景陽，姜文鳳，謝波.質(zhì)譜學(xué)報(bào))，2005，26(4):206－210.

［5］Catalina M I，Dnlluge J，Vreuls R J J，Brinkman U A T.J.Chromatogr.A，2000，877:153 －166.

［6］Lan Z Y，Martha J M W.J.Chromatogr.A，2007，1143:16－25.

［7］Liu J，Zhu Y，Qi B K，Tan J Y.J.Anal.Sci.(劉娟，朱昱，齊寶坤，譚家鎰.分析科學(xué)學(xué)報(bào))，2010，26(1):47－50.

［8］Cai C P，Wang D H，Wu L W，Chen X H.Inspection and Quarantine Science(蔡春平，王丹紅，吳靈威，陳曉華.檢驗(yàn)檢疫科學(xué))，2004，14(6):23－25.

［9］Adriana F，Santiago R.J.Chromatogr.A，2004，1024:267－274.

［10］Pozo O，Pitarch E，Sancho J V.J.Chromatogr.A，2001，923:75－85.

［11］Lagana A，Bacaloni A，Leva I.Chromatographia，2002，56(5/6):337－343.

［12］Wu J M，Ee K H，Lee H K.J.Chromatogr.A，2005，(1082):121－127.

［13］Mou R X，Chen M X.J.Instrum.Anal.(牟仁祥，陳銘學(xué).分析測試學(xué)報(bào))，2008，127(9):973－976.

［14］Niu Z Y，Luo X，Tang Z X，Ye X W，Sun Y F，Zhang H W，Wang F M.Chin.J.Anal.Chem.(牛增元，羅忻，湯志旭，葉曦雯，孫銀峰，張鴻偉，王鳳美.分析化學(xué))，2009，37(4):505－510.

［15］Cheng J，Ding L，Jiang J S，Lu Y J.Food Sci.(程靜，丁磊，蔣俊樹，盧業(yè)舉.食品科學(xué))，2010，31(20):389－393.

［16］Hong H Y，Zhang X F，Wei Y，Yin P J，Hao S H.Agrochemicals(洪海燕，張相飛，魏艷，殷培軍，郝雙紅.農(nóng)藥)，2009，48(10):744－746.