戴劍漉，趙小峰，赫衛(wèi)清，賈曉宇，李慧寧，王以光

可利霉素又稱必特螺旋霉素（BT），是利用基因工程技術(shù)將 4''-異戊?；D(zhuǎn)移酶基因（4''-isovaleryltransferase gene，ist）在螺旋霉素宿主菌中異源表達(dá)后的發(fā)酵產(chǎn)物[1-2]，其主組分為 4''-異戊酰螺旋霉素，此外，還含有少量 4''-?；穆菪顾兀虼?，BT 是一個(gè)多組分抗生素。BT 中的多種組分均具有抗菌活性，同時(shí)其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物也具有抗菌活性。因此，采用微生物法進(jìn)行其藥代動(dòng)力學(xué)研究，可以比較全面地評(píng)價(jià)其在體內(nèi)的生物活性。然而由于微生物法受檢定菌敏感度的限制，往往其檢測靈敏度不理想[3]，且 BT 在體內(nèi)組織滲透性強(qiáng)，導(dǎo)致其血漿濃度偏低，組織濃度高[4]。因此，建立較靈敏的微生物檢測方法對于以體內(nèi)活性為目標(biāo)的 BT 藥代動(dòng)力學(xué)研究至關(guān)重要。BT 藥品的含量測定方法系采用管碟法，參考《中國藥典》[5]乙酰螺旋霉素微生物檢定法，已經(jīng)建立了 BT微生物檢定法。但抗生素微生物檢定法影響因素較多[6]，且血漿直接測定微生物方法的靈敏度受限。本文擬通過研究檢定菌液濃度、培養(yǎng)基、緩沖液、血漿以及血漿處理等對 BT 檢測的影響，提高微生物法測定 BT 的靈敏度，以滿足該藥藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 魚胨、牛肉浸膏、牛肉蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物為生化試劑；葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無水碳酸鈉、乙酸乙酯和異丙醇為分析純；乙腈為色譜純；特級(jí)胎牛血清由北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所提供；藤黃八疊球菌[CMCC(B) 28001]由中國食品藥品檢定研究院提供；可利霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào) 167201207001）效價(jià) 926 μg/mg，由沈陽同聯(lián)集團(tuán)有限公司提供；健康人空白血漿由北京大學(xué)第一醫(yī)院血庫提供；健康人血漿取自經(jīng)過倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)的進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)的 2 名健康受試者。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 LB 培養(yǎng)基（g/L） 胰蛋白胨 10.0，酵母提取物 5.0，NaCl 10.0，pH 7.0。

1.1.2.2 抗生素檢定培養(yǎng)基（g/L） ①魚胨 6.0，葡萄糖 1.0，牛肉浸膏 1.5，酵母提取物 6.0；②牛肉蛋白胨 10.0，牛肉浸膏 5.0；③牛肉蛋白胨 5.0，牛肉浸膏 2.5；④牛肉蛋白胨 2.5，牛肉浸膏 1.25。上述培養(yǎng)基均含瓊脂 1.2%，并用 1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH 至 7.8～8.0 或 8.8～9.0，121 ℃ 滅菌 30 min。

1.1.3 儀器 PB303-N 型電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LD5-10B 型離心機(jī)購自北京京立離心機(jī)有限公司；ZSD-A1270A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海智城分析儀器有限公司；Vortex-genie 2 型旋渦混合器購自美國 Scientific Industries 公司；UV-1800 型雙光束紫外可見分光光度儀購自日本島津公司；電子數(shù)顯卡尺，精度為0.01 mm。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

⑴磷酸鹽緩沖液的制備：稱取磷酸二氫鉀0.41 g，磷酸氫二鉀 5.59 g，溶于 1000 ml 蒸餾水中，過濾，115 ℃ 滅菌 30 min 即得 pH 7.8 的磷酸鹽緩沖液 I。在上述緩沖液配制過程中分別加入氯化鈉 10、20、30、35 g，得含氯化鈉濃度為 1.0%、2.0%、3.0%、3.5% 的 pH 7.8 磷酸鹽緩沖液 II、III、IV、V。

⑵0.05 mol/L 碳酸鈉溶液的制備：稱取 0.53 g無水碳酸鈉于 100 ml 容量瓶中，加滅菌蒸餾水定容至刻度備用。

⑶標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備：精密稱取 BT 標(biāo)準(zhǔn)品 10 mg，加 5 ml 乙醇溶解，并用滅菌水定容至100 ml，制成濃度為 1000 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4 ℃ 冷藏備用。

1.2.2 檢定平板的制備

⑴雙層：取融化的檢定培養(yǎng)基 15 ml 加入直徑為 90 mm 的雙碟中，凝固后作底層，再加 5 ml 菌層，搖勻，冷卻備用。

⑵單層：將融化的檢定培養(yǎng)基冷卻至 48 ～50 ℃，加入適量檢定菌，混勻后取 12 ml 加入直徑為 90 mm 的雙碟中，凝固后備用。

1.2.3 血漿樣品處理 按文獻(xiàn)[7] LC-MS/MS 法測定血漿樣本中 BT 的萃取方法，精密吸取 1.0 ml血漿樣品置 50 ml 干凈離心管中，加入 2 ml 水和500 μl 乙腈，混勻，加入堿化試劑（0.05 mol/L 碳酸鈉溶液）2 ml，乙酸乙酯-異丙醇（95∶5，V/V）提取溶劑 20 ml，渦流 1 min，振蕩 10 min 混勻，以3000 r/min，離心 10 min，分離上層有機(jī)相，于 25 ℃空氣流下吹干，干燥物溶于 100 μl 乙酸乙酯。

1.2.4 加樣法

⑴管碟法：牛津杯在培養(yǎng)基上靜置 5 min，使其在培養(yǎng)基內(nèi)沉降穩(wěn)定。用微量移液器分別于牛津杯內(nèi)定量滴加標(biāo)準(zhǔn)溶液 270 μl。用陶瓦圓蓋覆蓋雙碟，置托盤內(nèi)，以水平位置移入培養(yǎng)箱，37 ℃ 培養(yǎng) 16～18 h，電子數(shù)顯卡尺量取抑菌圈直徑。

⑵紙片法：用打孔器將厚型濾紙制成直徑為10 mm 的紙片，經(jīng)紫外線照射 20～30 min，存干燥處備用。用微量移液器分別吸取提取后的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品 100 μl 加入上述紙片中，于 37 ℃ 干燥 30 min 后將干燥紙片移至單層檢定平板，使紙片與培養(yǎng)基貼平，置 37 ℃ 培養(yǎng) 16～18 h，量取抑菌圈直徑。

1.2.5 紙片法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取 1.0 ml 空白人血漿分別配制 BT 濃度為 20、50、100、125、150、175 ng/ml 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 1.2.3 血漿樣品處理項(xiàng)下方法處理樣品，滴加至 1.2.4 項(xiàng)所述紙片，置于單層檢定平板中[檢定培養(yǎng)基③，藤黃八疊球菌液 OD600＝ 1.0，加入量 0.5%]，置 37 ℃培養(yǎng) 16～18 h，量取抑菌圈直徑，并以血漿中 BT標(biāo)準(zhǔn)品藥物濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 BT 初始檢測靈敏度的確定

按藥典方法采用培養(yǎng)基①制備雙層檢定平板，用 pH 7.8 的磷酸鹽緩沖液 I 將 BT 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為系列濃度，藤黃八疊球菌為檢定菌，37 ℃過夜培養(yǎng)，菌液以 0.5%（V/V）加入培養(yǎng)基，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)條件下可檢測 BT 濃度為 0.6 μg/ml（表 1）。

2.2 培養(yǎng)基 pH 對 BT 檢測靈敏度的影響

采用培養(yǎng)基①、②制備雙層檢定平板，pH 均調(diào)節(jié)至 7.8～8.0 或 8.8～9.0，管碟法加樣。結(jié)果表明兩種培養(yǎng)基在 pH 8.8～9.0 時(shí)，靈敏度均較pH 7.8～8.0 敏感，其中培養(yǎng)基②更為敏感（表 2）。

表1 BT 初始檢測靈敏度的確定（n = 6）Table1 Preliminary sensitivity of BT (n = 6)

表2 培養(yǎng)基 pH 對 BT 檢測靈敏度的影響（n = 6）Table2 Effect of medium pH on sensitivity of BT (n = 6)

2.3 檢定菌液濃度對 BT 檢測靈敏度的影響

將上述培養(yǎng)的藤黃八疊球菌原始菌液適當(dāng)稀釋（OD600= 0.3～1.0），與原始菌液進(jìn)行比較，培養(yǎng)基②雙層管碟法，檢測 BT 系列稀釋液的抑菌情況。結(jié)果表明檢定菌濃度的降低可以提高 BT 檢測的靈敏度，其檢測限值達(dá)到 0.4 μg/ml（表 3）。

2.4 檢定平板單雙層對 BT 檢測靈敏度的影響

采用培養(yǎng)基②制備單層和雙層檢定平板，管碟法加樣，菌液濃度為 OD600= 0.3～1.0。檢測 BT 系列稀釋液的抑菌情況。結(jié)果表明單層平板可以有效提高 BT 檢測的靈敏度，其檢測限值為 0.2 μg/ml（表 4）。

2.5 檢定培養(yǎng)基對 BT 檢測靈敏度的影響

采用培養(yǎng)基②、③、④制備單層檢定平板，管碟法加樣，菌液濃度為 OD600= 0.3～1.0。研究不同培養(yǎng)基配方檢測 BT 系列稀釋液的抑菌情況。結(jié)果見表 5，表明培養(yǎng)基③、④檢測限值均為0.14 μg/ml，但檢定菌在培養(yǎng)基④生長極弱，抑菌圈邊緣模糊，而在培養(yǎng)基③生長適中，抑菌圈邊緣清晰，因此確定培養(yǎng)基③為下一步實(shí)驗(yàn)用檢定培養(yǎng)基。

2.6 NaC1 濃度對 BT 檢測靈敏度的影響

根據(jù)緩沖液中鹽濃度提高可加快抗生素分子擴(kuò)散的原理[8]，在稀釋 BT 使用的 pH 7.8 磷酸鹽緩沖液中加入濃度為 1.0%、2.0%、3.0% 和 3.5%的 NaCl，菌液濃度為 OD600= 0.3～1.0，檢測不同濃度 NaCl 對檢測 BT 靈敏度的影響，結(jié)果表明使用含 3.0% NaCl 的 pH 7.8 磷酸鹽緩沖液可以提高BT 檢測靈敏度，其檢測限值為 0.1 μg/ml（表 6）。

2.7 胎牛血清和人血漿中檢測 BT 的靈敏度

分別將磷酸鹽緩沖液和 NaCl 溶液與胎牛血清混合，或直接用胎牛血清和人血漿稀釋 BT，比較不同條件對檢測 BT 靈敏度的影響，結(jié)果表明以胎牛血清作為稀釋液，BT 檢測限達(dá)到 0.1 μg/ml；以人血漿作為稀釋液，BT 檢測限達(dá)到 0.2 μg/ml（表 7）。

表3 檢定菌液濃度對 BT 檢測靈敏度的影響（n = 6）Table3 Effect of concentration of test bacterium suspension on sensitivity of BT (n = 6)

表4 檢定平板單雙層對 BT 檢測靈敏度的影響（n = 6）Table4 Effect of single or double layer assay plates on sensitivity of BT (n = 6)

表5 檢定培養(yǎng)基對 BT 檢測靈敏度的影響（n = 6）Table 5 Effect of test medium on sensitivity of BT (n = 6)

表6 NaCl 對 BT 檢測靈敏度的影響*（n = 6）Table6 Effect of NaCl on sensitivity of BT (n = 6)

表7 胎牛血清和人血漿中檢測 BT 的靈敏度*（n = 6）Table7 Sensitivity of BT in fetal bovine serum (FBS)and plasma (n = 6)

2.8 紙片法檢測人血漿中 BT 的濃度

2.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 上述實(shí)驗(yàn)表明，人血漿中的成分對 BT 在檢定平板的擴(kuò)散有一定影響，為了進(jìn)一步提高在人血漿中檢測 BT 的靈敏度，必須排除人血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對 BT 檢測的干擾。參照文獻(xiàn)[5]從血漿中萃取 BT，制作測定 BT 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y = 11.468X–2.519，r2= 0.9981（n = 6）（圖 1），BT 的最低檢測濃度為0.02 μg/ml。

2.8.2 紙片法在健康受試者血樣中檢測 BT 的應(yīng)用 2 名健康受試者單次服用 BT 400 mg 后，于2.0、3.0、4.0 h 采集血樣，離心分離出的血漿樣品萃取后進(jìn)行稀釋，以紙片法進(jìn)行檢測，結(jié)果見表 8，由于所用設(shè)備及條件所限，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較大，但初步結(jié)果顯示所建立方法可應(yīng)用于血漿樣品中 BT的檢測。

圖1 紙片法測定人血漿中 BT 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure1 Standard curve of BT concentration in plasma using paper disk method

表8 紙片法檢測人血漿中 BT 濃度（n = 3）Table8 Concentration of BT in plasma using paper disk method (n = 3)

3 討論

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（2005年3月版）的要求，血藥濃度的微生物法測定在 BT 新藥申報(bào)中至關(guān)重要。然而，由于 BT 藥代學(xué)的特點(diǎn)以及受檢定菌敏感度的限制，按照已建立的 BT 微生物法測定其效價(jià)的方法不能滿足藥動(dòng)學(xué)研究的要求。

本實(shí)驗(yàn)通過考察檢定培養(yǎng)基配方、檢定菌濃度、檢定平板、稀釋緩沖液中添加 NaCl 和胎牛血清對 BT 檢測的影響，發(fā)現(xiàn)采用營養(yǎng)較為貧乏的配方、控制檢定菌的濃度、采用單層培養(yǎng)平板和在稀釋緩沖液中添加 NaCl 等措施，可以有效地提高BT 微生物法檢測的靈敏度。使用培養(yǎng)基③配方，菌液濃度控制在 OD600為 0.3～1.0 制作單層檢定平板，用管碟法檢測 BT 的檢測限由 0.6 μg/ml降低至 0.1 μg/ml 左右，靈敏度提高了 6 倍。本研究建立的從血漿中萃取 BT 的紙片檢測方法，使BT 在血漿中的檢測限下降至 0.02 μg/ml。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為順利完成 BT 在人體藥代動(dòng)力學(xué)中血藥濃度微生物法的檢測奠定了良好基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他抗菌藥物藥動(dòng)學(xué)研究中血藥濃度的微生物法測定提供了參考。

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