李美荃，張春勇，滿 意，安清聰，陳克嶙，郭榮富

(云南農(nóng)業(yè)大學 云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南 昆明 650201)

在現(xiàn)代仔豬生產(chǎn)中，由于大量使用抗生素導致藥物殘留和耐藥性的問題備受社會關注，研究和使用抗生素替代品是改善仔豬健康和生產(chǎn)性能的有效途徑之一博落回提取物。(MCE)主要成分-生物堿有很強的生物活性，具有抗菌、抗腫瘤、改善肝功能、抗瘧、殺蟲等功效。Pavel Kosina[1]研究表明，含有MCE、血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿等對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌均具有一定的抑制作用。萬學攀[2]用博落回生物堿分離得到的部分物質(zhì)進行了抑菌活性的檢測，以血根堿和白屈菜紅堿為主要成分的混合物抑菌效果最好，除沙門氏菌外，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、無乳鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、蠟樣芽孢桿菌有很好的抑制效果。MCE中的血根堿有很強的廣譜抑菌作用。何夏陽[3]在斷奶仔豬飼糧中添加0.5 mg/kg血根堿顯著提高了斷奶仔豬平均日增重、降低了料重比和腹瀉率。由于抗生素藥物殘留和耐藥性問題而不能大量使用的情況下，植物提取物作為飼料添加劑使用是目前研究熱點，而MCE作為仔豬抗生素替代品具有研究價值和應用前景。本試驗旨在研究MCE對病原微生物的抑菌效力、細胞應激參數(shù)、斷奶仔豬生產(chǎn)性能、血液免疫和抗氧化參數(shù)的影響，為MCE在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選用健康PIC五元仔豬60頭，35日齡斷奶，隨機分成5個處理組，每組4個重復，每個重復3頭。A組為對照組，飼喂基礎日糧，B、C和D組分別飼喂添加2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg MCE的試驗日糧，E組飼喂添加50 mg/kg土霉素的試驗日糧。試驗期為35～60日齡。

本研究萃取的MCE經(jīng)高效液相色譜法測定，生物總堿含量為64%，其中血根堿含量為45%，白屈菜紅堿含量為19%。

選用大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌進行MCE抑菌效力試驗。

選用豬皮膚成纖維細胞(由本實驗室提供)，參照駱雪[4]方法，采用LPS誘導細胞建立應激模型。

1.2 基礎日糧配制

以可消化氨基酸為基礎，參照NRC(1998)豬營養(yǎng)需要和PIC五元雜交豬種營養(yǎng)需要量配制基礎日糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

仔豬自由采食和飲水，按種豬場常規(guī)飼養(yǎng)和免疫規(guī)程進行飼養(yǎng)管理。記錄采食量。

1.4 測定指標與方法

試驗開始和結束時，分別空腹稱重和計算60日齡日增重、日采食量和料重比。60日年齡時，前腔靜脈采血5 mL，制備血清備用。細胞培養(yǎng)液IgG、LSZ和血清IgG、LSZ、SOD、MDA、GSH-Px采用全自動生化分析儀測定，試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。參照駱雪等(2012)方法，測定MCE抑菌效力和MCE最小抑菌濃度。

表1 基礎日糧與營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Basal diet and nutrient levels (air-dry basis)

注：①預混料為每千克飼料提供：鐵 120 mg；銅 200 mg；錳 80 mg；鋅 100 mg；碘 0.3 mg；維生素A 12 000 IU；維生素D 3 000 IU；維生素E 28 IU；維生素K35 mg；維生素B13 mg；維生素B28 mg；維生素B62 mg；維生素B120.04 mg；泛酸 22 mg；膽堿 0.024 g；尼克酸 40 mg；生物素 0.2 mg；葉酸 1 mg。 ②消化能為計算值，其余為實測值。

Note:①The premix provided the following per kg of diet: Fe 120 mg;Cu 200 mg;Mn 80 mg;Zn 100 mg;I 0.3 mg;VA 12 000 IU;VD 3 000 IU;VE 28 IU;VK35 mg;VB13 mg;VB28 mg;VB62 mg;VB120.04 mg;pantothenic acid 22 mg;choline chloride 0.024 g;nicotinic acid 40 mg;biotin 0.2 mg;folic acid 1 mg;②DE was a calculated value，while the others were measured values.

1.5 試驗數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 8.2軟件處理和分析，對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，對差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較。所有試驗結果采用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 MCE的抑菌效力與最小抑菌濃度

2.1.1 MCE的抑菌效力 由表2可知，隨MCE溶液濃度增大，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果增強,抑菌圈直徑也逐漸增大見圖1，MCE對4種細菌的抑制效果分別是：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌。

2.1.2 MCE的最小抑菌濃度 將MCE溶液按2 560 μg/mL、1 280 μg/mL、640 μg/mL、320 μg/mL、160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL的濃度梯度測定最小抑菌濃度，結果見表3。觀察發(fā)現(xiàn)，MCE稀釋度越大，肉湯越渾濁，說明細菌生長越多。MCE對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為1 280 μg/mL、1 280 μg/mL、2 560 μg/mL、2 560 μg/mL。

表2 不同濃度博落回提取物對腸道微生物抑制效果(抑菌圈直徑，mm)Table 2 Different concentrations of Macleaya cordata extract inhibited the intestinal microbiota (diameter of inhibited halo, mm)

圖1 不同濃度博落回提取物對腸道微生物抑制效果(抑菌圈直徑，mm)Fig.1 Different concentrations of Macleaya cordata extract inhibited the intestinal microbiota (diameter of inhibited halo, mm)

注：A:大腸桿菌；B：沙門氏菌；C：金黃色葡萄球菌；D枯草芽孢桿菌

Note:A:Escherichiacoli;B:Salmonella;C:Staphylococcusaureus;D:Bacillussubtilis

表3 MCE的最小抑菌濃度Table 3 Macleaya cordata extract minimum inhibitory concentration determination

注：“-”表示沒有長菌，“+”表示少量長菌，“++”表示適度長菌，“+++”表示大量長菌。

Note:“-”means no bacteria,“+”means a small amount of bacteria,“++”means bacteria modest,“+++”means a large number of long-bacteria.

2.2 MCE對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

由表4可知，35～60 d，C組日采食量比對照組提高了6.7%(P<0.05)，B組與C組日采食量差異不顯著(P>0.05)；C組日增重比對照組提高了9.0%(P<0.05)，B組與C組日增重差異不顯著(P>0.05)；B、C組料重比顯著低于A、D、E組(P<0.05)。

表4 飼糧添加MCE對斷奶仔豬生長性能的影響Table 4 Effects of Macleaya cordata extract on the growth performance for weanling piglets kg

注：同行數(shù)據(jù)肩標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note:In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05), and those with the same letter superscripts or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05),and those with different capital letter superscripts mean extreme difference (P<0.01).The same below.

2.3 MCE對細胞培養(yǎng)液免疫參數(shù)和仔豬血清理化指標的影響

由圖2(a)可見，60日齡時，三組MCE添加組血清IgG極顯著高于對照組(P<0.01)和土霉素組(P<0.01)，C組血清中IgG含量極顯著高于B、D組(P<0.01)，E組血清IgG極顯著高于對照組(P<0.01)。但是C組極顯著高于E組(P<0.01)。由圖2(c)可見，C組血清LSZ極顯著高于A組和D組(P<0.01)，E組血清LSZ極顯著高于A、B、C、D組(P<0.01)，A、B組間差異不顯著(P>0.05)。

由圖2(b)可見，LPS刺激后，在加入不同濃度MCE提取物之后，細胞培養(yǎng)液中IgG含量極顯著高于對照組(P<0.01)，并且極顯著高于土霉素組(P<0.01)；土霉素組細胞培養(yǎng)液中IgG高于對照組(P<0.01)。由圖2(d)可見，MCE添加組細胞培養(yǎng)液中LSZ極顯著高于對照組(P<0.01)；土霉素組與150 ng/mL MCE添加組LSZ含量差異不顯著(P>0.05)，但是150 ng/mL MCE添加組與土霉素組LSZ含量顯著高于50 ng/mL組及100 ng/mL組(P<0.05)。

圖2 斷奶仔豬血清IgG(a)與LSZ(c)及細胞培養(yǎng)液IgG(b)與LSZ(d)含量變化情況柱狀圖Fig.2 The histogram for IgG (a), LSZ(c) content of weaning piglets serum and IgG (b),LSZ (d) content of cell cultures fluid

2.4 MCE對斷奶仔豬血清抗氧化參數(shù)的影響

日糧中添加MCE后血清T-SOD極顯著高于對照組(P<0.01)，且與土霉素組相比差異極顯著(P<0.01)；對照組血清T-SOD含量極顯著高于土霉素組(P<0.01)。B、C、D組血清MDA含量極顯著低于對照組和土霉素組(P<0.01)；MCE添加組間血清MDA含量差異極顯著(P<0.01)，C組極顯著低于B和D組(P<0.01)；土霉素組MDA含量極顯著高于對照組和MCE添加組(P<0.01)。MCE添加組GSH-Px與空白對照組差異不顯著，但土霉素組都極顯著高于其他四組(P<0.01)。

3 討 論

3.1 MCE對腸道病原微生物的抑制作用

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，MCE對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌高度敏感，對沙門氏菌中度敏感；MCE對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為1280、1280、2560、2560 μg/mL。有研究報道，MCE中血根堿在pH為6.5時對變形鏈球菌、齲齒鏈球菌、血鏈球菌、粘性鏈球菌及內(nèi)氏放線的最低抑制濃度在4～8 μg/mL之間，并且氫離子濃度影響血根堿的抑菌活性，在抑菌活性方面血根堿與鋅具有協(xié)同作用[5]。除了抑制細菌之外，MCE對真菌也有不同抑制作用，李靜[6]等用MCE制成血根堿酊劑，以維達寧為陽性對照，測定其對4種皮癬真菌抑制效果，結果表明，血根堿酊劑對4種皮癬真菌均具較強的抑制作用，對須癬毛癬菌和許蘭黃癬菌的抑制作用尤為明顯。Vrublova1[7]用糖酐酯誘導大鼠產(chǎn)生大腸炎，結果表明，含有MCE的飼料添加劑組能減小直腸粘膜損傷，降低直腸髓過氧化物酶活性及環(huán)氧化酶2蛋白水平。劉靖[8]研究發(fā)現(xiàn)，MCE可以促進黃雞小腸絨毛形態(tài)結構的發(fā)育，改善小腸的消化吸收功能。說明MCE可能是通過抑制腸道有害微生物的生長來促進動物機體腸道內(nèi)健康微生物菌群的形成，降低腸道pH值，從而阻止了病原微生物在腸內(nèi)的生殖，增加了動物機體對外源性病原菌的抵抗作用。上述報道與本實驗結果基本一致，其影響程度與作用機理尚待進一步研究。

表5 MCE對血清 T-SOD，MDA 和GSH-Px含量的影響Table 5 Effect of Macleaya cordata extract on blood T-SOD，MDA and GSH-Px for weaned piglets

3.2 MCE改善斷奶仔豬生產(chǎn)性能

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，適宜水平的MCE添加于基礎飼料中，對斷奶仔豬的生產(chǎn)性能有不同程度的改善。在35～60日齡，基礎日糧中添加2.5、5、7.5 mg/kg MCE，對仔豬的平均日增重，平均日采食量及料重比的改善效果明顯優(yōu)于土霉素。這一結果與蔡鵬[9]等報道的，三元仔豬日糧中苯并啡啶類生物堿的添加量0.675 mg/kg(以血根堿+白屈菜紅堿總生物堿計)為理想劑量不一致。但是MCE能提高日增重，降低料重比，這一結果與饒華[10]等研究結果一致，結果提示我們，MCE適宜添加量可能與豬品種和日糧組成及有效成分含量有關。其適宜添加水平有待于進一步研究。

3.3 MCE對仔豬血清及細胞培養(yǎng)液免疫應激參數(shù)的影響

IgG是動物自然感染和人工主動免疫后機體產(chǎn)生的主要抗體，是動物機體抗感染的主力，在體內(nèi)發(fā)揮抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫學活性。本實驗中，隨日糧MCE添加水平提高，仔豬血清中IgG含量也升高，日糧中添加5 mg/kg MCE與空白對照組相比顯著提高了血清中IgG含量(P<0.01)且與土霉素組相比也有顯著提高(P<0.01)，說明MCE能顯著提高仔豬血清中IgG含量，從而達到提高斷奶仔豬自身免疫能力，抵御外界微生物入侵，增強斷奶抗病能力。仔豬在斷奶時會有斷奶應激出現(xiàn)，此時，斷奶應激可降低仔豬體循環(huán)抗體水平，抑制細胞免疫能力。MCE提高血清IgG則有利于減小斷奶應激對仔豬的影響，提高成活率。另外，細胞培養(yǎng)試驗中，MCE添加組IgG含量高于對照組和土霉素組(P<0.01)，土霉素組也顯著高于對照組(P<0.01)，說明MCE和土霉素均能誘導細胞產(chǎn)生IgG。其作用機制有待于進一步研究。

LSZ有較寬的抑菌譜，對革蘭氏陽性細菌有滅殺作用，另外，并能改善細胞抑制劑所導致的白細胞減少，結合細菌LPS，減輕內(nèi)毒素作用，從而增強機體的抵抗力，提高動物的健康水平。在畜禽養(yǎng)殖中，溶菌酶可以提高仔豬生產(chǎn)性能、降低腹瀉率，增強免疫力[11]。本試驗中，添加5 mg/kg MCE和土霉素組相較于不添加組，血清中LSZ分別提高了20.7%和47.9%，說明MCE和土霉素都能提高機體LSZ活力，增強機體的非特異性免疫能力，但與土霉素相比，MCE為天然植物產(chǎn)物，不存在使用過后耐藥性、藥物殘留等問題，對于解決抗生素使用帶來的問題具有積極意義。另外，細胞培養(yǎng)試驗中，適宜MCE添加組LSZ含量高于對照組和土霉素組，但差異不顯著。

3.4 MCE對仔豬血清抗氧化參數(shù)的影響

機體抗氧化防御體系中，T-SOD和GSH-Px對氧化與抗氧化平衡起著至關重要作用。本試驗中，添加MCE組仔豬血清中總SOD顯著高于對照組和土霉素組(P<0.01)，而血清中GSH-Px含量與對照組持平，卻低于土霉素組(P<0.05)，說明GSH-Px可能處于被抑制狀態(tài)。有研究表明，在機體的抗氧化系統(tǒng)內(nèi)可能存在著某種動態(tài)平衡機制，作為抗氧化系統(tǒng)的SOD和GSH-Px在某種狀況下并非同時增加，而是一種機制激活時，另一種可能處于被抑制狀態(tài)[12]。其作用機理有待于進一步研究。

MDA是脂質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物，其含量的高低間接反映機體受氧自由基攻擊的嚴重程度。本試驗MCE添加組仔豬血清中MDA極顯著低于對照組和土霉素組(P<0.01)，說明MCE提取物能夠保護動物機體細胞，降低氧自由基對機體的損害。

4 結 論

MCE對腸道致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌都有抑制作用；MCE能顯著改善斷奶仔豬生產(chǎn)性能，提高血清IgG、T-SOD，降低血清MDA含量，增強仔豬抗病力及抗氧化能力；并能緩解細胞應激的損傷。提示MCE可以替代抗生素應用于仔豬生產(chǎn)。

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