王麗嬋，馬霄，張華捷，譚亞軍，徐穎華，張庶民，侯啟明

金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種外毒素，為水溶性的蛋白質(zhì)，可引起食物中毒，由于其免疫激活作用極其強(qiáng)大，White等[1]將其定義為超抗原。超抗原與普通異種抗原不同，它不需要經(jīng)過(guò)抗原遞呈細(xì)胞（APC）的處理，在主要組織相容性復(fù)合體（MHC）II 類(lèi)分子的作用下，只需極小劑量（10-12mol/L）就可以刺激比普通抗原多數(shù)千倍的Vβ 特異性 T 細(xì)胞增殖，并釋放大量細(xì)胞因子，是一種較好的免疫調(diào)節(jié)劑和增效劑[2-3]。根據(jù)血清型的不同將金黃色葡萄球菌的腸毒素主要分為SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE 七種類(lèi)型，其中 SEA是最常見(jiàn)的一種[4]。

凡能非特異地通過(guò)物理或化學(xué)的方式與抗原結(jié)合或混合，并增強(qiáng)抗原免疫反應(yīng)性（包括細(xì)胞免疫或體液免疫）的物質(zhì)均可稱(chēng)之為佐劑。目前常用的佐劑有鋁佐劑、蛋白類(lèi)佐劑、含脂類(lèi)佐劑及核酸類(lèi)佐劑等，其中臨床應(yīng)用最多、最成熟的是鋁佐劑。本文的主要目的是初步探討重組超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素 A 作為免疫佐劑功能的可行性。如前所述，多項(xiàng)研究已經(jīng)表明[5-6]，SEA只需極小劑量即可激活大量 T 細(xì)胞，并釋放多種細(xì)胞因子，刺激 T 細(xì)胞的活性，提高機(jī)體免疫水平，特別是細(xì)胞免疫水平，這些特性使其具備作為免疫佐劑的潛力。本實(shí)驗(yàn)室在前期超抗原抗腫瘤研究中已經(jīng)證實(shí)，金黃色葡萄球菌腸毒素能夠激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，誘導(dǎo) Th1 型細(xì)胞因子的產(chǎn)生[7]。本次研究主要是觀察其誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的能力，用 SEA與破傷風(fēng)類(lèi)毒素（tetanus toxoid，TT）和Al(OH)3佐劑聯(lián)合免疫小鼠，檢測(cè)小鼠的體液免疫效果，初步探討 SEA的佐劑效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及佐劑 破傷風(fēng)類(lèi)毒素由華蘭生物工程股份有限公司提供；重組SEA 由本科室前期制備；Al(OH)3佐劑由北京天壇生物制品股份有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) NIH 小鼠 64只，14～16 g，雌雄各半，購(gòu)自本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房。

1.1.3 主要試劑與儀器 HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 為美國(guó) Santa Cruz公司產(chǎn)品；ELISA 酶標(biāo)板為美國(guó) Costar公司產(chǎn)品；OPD 顯色試劑為美國(guó)Ameresco公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國(guó) Molecμlar Devices公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及免疫 NIH 小鼠 64只，隨機(jī)分成 8組，每組8只，腹部皮下免疫 0.5ml/只。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)大組，分別是破傷風(fēng)類(lèi)毒素高劑量組（1 lf/ml）和破傷風(fēng)類(lèi)毒素低劑量組（0.25 lf/ml）；兩個(gè)劑量的TT 分別與高（80μg/ml）、中（20μg/ml）、低（5μg/ml）3個(gè)劑量的超抗原 SEA結(jié)合，以便確定 SEA的最適劑量；各個(gè)組均與終濃度為1.5 mg/ml的Al(OH)3佐劑 4 ℃ 吸附過(guò)夜。

1.2.2 小鼠血清抗體 IgG 水平檢測(cè) 動(dòng)物免疫4周后，摘眼球采血，分離血清待用。利用破傷風(fēng)類(lèi)毒素包被，3 lf/ml，每孔 100 μl，測(cè)定免疫后小鼠血清破傷風(fēng)類(lèi)毒素抗體 IgG 水平。將各組小鼠免疫血清以 1∶100 起進(jìn)行 2 倍倍比 8個(gè)系列稀釋?zhuān)瑯?biāo)準(zhǔn)孔以百白破聯(lián)合疫苗免疫小鼠后4周血清作為對(duì)照，以 1∶400 起進(jìn)行 2 倍倍比 8個(gè)系列稀釋?zhuān)尤胍寻豢乖拿笜?biāo)板中，置37 ℃ 溫育 1 h。洗板后，加入 HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG，37 ℃ 溫育 1 h；洗板后，每孔加入顯色液 100 μl，室溫放置15 min；加入 2 mol/L 終止液，于30 min內(nèi)測(cè)定在波長(zhǎng) 490 nm 處的各孔 A 值。將標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照所含的破傷風(fēng)類(lèi)毒素抗體含量設(shè)置為1，用SoftMax pro 軟件，應(yīng)用四參數(shù)、雙平行線分析方法對(duì)各樣品組的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算抗體的酶標(biāo)單位數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 IBM SPSS Statistics 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TT 高劑量組小鼠血清抗體 IgG 檢測(cè)結(jié)果

TT 高劑量免疫組，主要檢測(cè)在TT 及Al(OH)3免疫劑量不變的條件下，不同濃度的重組超抗原 SEA 對(duì) TT的免疫增強(qiáng)作用。ELISA 法檢測(cè)免疫后4周的小鼠血清抗 TT 抗體水平，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

由檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，SEA 高劑量組及中劑量組均能顯著增強(qiáng) TT的免疫原性（P＜0.05），且兩個(gè)劑量之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）；但 SEA 低劑量組未能增強(qiáng) TT 免疫原性，與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。

表1 TT 高劑量組免疫后小鼠血清抗 TT 抗體IgG 檢測(cè)（ ，n=8）Table1 Anti-TT IgG levels of immunized mice after immunization with high doses of TT groups ( , n=8)

表1 TT 高劑量組免疫后小鼠血清抗 TT 抗體IgG 檢測(cè)（ ，n=8）Table1 Anti-TT IgG levels of immunized mice after immunization with high doses of TT groups ( , n=8)

注：*和對(duì)照組比較，P＜0.05。Note: *Compared with control group, P＜0.05.

對(duì)照組 Control group 0.906±0.572 /SEA 高劑量組 SEA high dose 1.979±0.598* 0.001 SEA 中劑量組 SEA middle dose 1.734±0.725* 0.006 SEA 低劑量組 SEA low dose 0.708±0.207 0.49

表2 TT 低劑量組免疫后小鼠血清抗 TT 抗體IgG 檢測(cè)（ ，n=8）Table2 Anti-TT IgG levels of immunized mice after immunization with low doses of TT groups ( , n=8)

表2 TT 低劑量組免疫后小鼠血清抗 TT 抗體IgG 檢測(cè)（ ，n=8）Table2 Anti-TT IgG levels of immunized mice after immunization with low doses of TT groups ( , n=8)

注：*和對(duì)照組比較，P＜0.05。Note: *Compared with control group, P＜0.05.

抗 TT 抗體水平Anti-TT IgG levels P 值P value對(duì)照組 Control group 0.092±0.115 /SEA 高劑量組 SEA high dose 0.484±0.199* 0.002 SEA 中劑量組 SEA middle dose 0.425±0.327* 0.005 SEA 低劑量組 SEA low dose 0.618±0.171* 0.001

2.2 TT 低劑量組小鼠血清抗體 IgG 檢測(cè)結(jié)果

TT 低劑量免疫組，檢測(cè)在TT 及Al(OH)3免疫劑量不變的條件下，不同濃度的SEA 對(duì)低劑量TT的免疫增強(qiáng)作用。檢測(cè)方法同上，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

與對(duì)照組相比，SEA的各個(gè)劑量組均能增強(qiáng)低劑量 TT的免疫原性，P＜0.05；且各個(gè)劑量組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。

結(jié)合以上兩個(gè)劑量 TT的免疫結(jié)果，可得出如下結(jié)論：①無(wú)論是對(duì)照組還是樣品組，高劑量 TT免疫組產(chǎn)生的抗體水平均高于低劑量免疫組；②對(duì)于不同劑量 SEA的免疫增強(qiáng)作用，在TT 高劑量組，高、中劑量的SEA 免疫協(xié)同增強(qiáng)作用相同，低劑量 SEA 與對(duì)照組相比未能增強(qiáng) TT 免疫原性；③ TT 低劑量免疫組，3 種不同劑量的SEA 均能協(xié)同增強(qiáng) TT的免疫原性，且各劑量之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；④從試驗(yàn)結(jié)果可看出，按照免疫佐劑用量最小化原則，SEA 協(xié)同增強(qiáng) TT 免疫原性的最適劑量為20μg/ml，無(wú)論是高劑量 TT組，還是低劑量 TT組，均能增強(qiáng)其免疫原性。

3 討論

金黃色葡萄球菌腸毒素 A 作為一類(lèi)高效免疫刺激分子，與MHC-II 類(lèi)分子和TCR 具有獨(dú)特的作用方式，組成三聚體復(fù)合物，進(jìn)而誘導(dǎo) T 細(xì)胞的大量增殖和細(xì)胞因子的釋放，活化 Th1 型細(xì)胞等效應(yīng)，提高機(jī)體免疫水平，尤其是細(xì)胞免疫水平。SEA 這些特性使其在腫瘤生物學(xué)治療方面的應(yīng)用日益廣泛，受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注，可單獨(dú)應(yīng)用[8]，也可與其他載體聯(lián)用制備融合蛋白發(fā)揮抑瘤作用[9-11]。近來(lái)，利用超抗原特性作為免疫佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑的研究也有所報(bào)道[12-13]。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中證實(shí)了此類(lèi)超抗原激活細(xì)胞免疫及其抗腫瘤效果[7]，在本次實(shí)驗(yàn)中主要是觀察重組SEA與TT 聯(lián)合免疫后對(duì) TT的體液免疫增強(qiáng)作用。

為了確定重組SEA的最適使用劑量，實(shí)驗(yàn)中將 TT 分高劑量組和低劑量組，每個(gè)劑量組又分別與高、中、低 3個(gè)劑量的SEA 同時(shí)與Al(OH)3吸附后免疫小鼠。體液免疫檢測(cè)結(jié)果顯示，在TT 高劑量組，高、中劑量的SEA 均能顯著增強(qiáng) TT的抗體水平，而低劑量 SEA組的檢測(cè)結(jié)果在數(shù)值上卻略低于對(duì)照組，但這并不能說(shuō)明低劑量的SEA會(huì)干擾甚至降低 TT的免疫原性，因?yàn)閮烧呓?jīng)統(tǒng)計(jì)分析后并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造成此種現(xiàn)象的潛在原因如下：首先是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身的個(gè)體差異較大，致使對(duì)同一抗原的免疫反應(yīng)差異；其次是實(shí)驗(yàn)操作者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能存在誤差，比如動(dòng)物免疫、ELISA測(cè)定等環(huán)節(jié)。在實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下，可通過(guò)加大樣本量來(lái)減少或消除造成這些誤差的潛在因素。在TT 低劑量組，高、中、低劑量的SEA 均能增強(qiáng) TT的免疫原性，且各劑量組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與對(duì)照組[Al(OH)3+ TT]相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上這些結(jié)果說(shuō)明對(duì)于TT 抗原來(lái)說(shuō)，SEA的最適使用劑量與TT的濃度有關(guān)，TT 免疫劑量越低，SEA 對(duì)其免疫增強(qiáng)作用越明顯，且達(dá)到同樣的免疫增強(qiáng)效果的同時(shí)所需 SEA 劑量越小。但綜合兩個(gè) TT 免疫劑量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在SEA 濃度為20μg/ml，即小鼠免疫劑量為10 μg/只時(shí)，對(duì)高劑量 TT和低劑量 TT 均有較強(qiáng)的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用，因此對(duì) TT 來(lái)說(shuō)，SEA的最適劑量為20μg/ml。本實(shí)驗(yàn)中只研究了重組SEA 對(duì) TT 抗原的免疫增強(qiáng)作用與免疫劑量之間的關(guān)系，但是，對(duì) TT 免疫增強(qiáng)作用的最適劑量并不一定適合其他種類(lèi)的抗原，因此，SEA的使用劑量還需依抗原而定。

理論上，試驗(yàn)中應(yīng)該在不同時(shí)間點(diǎn)取血檢測(cè)抗體產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)水平，這樣可以更全面地監(jiān)測(cè)免疫后產(chǎn)生抗體高峰期的時(shí)間。但本研究只是對(duì) SEA 協(xié)同增強(qiáng) TT的免疫原性在抗體水平上進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，想通過(guò)增加 SEA 成分，在不影響或增加 TT保護(hù)力的同時(shí)，減少 TT的使用量。加之根據(jù)《中國(guó)藥典》[14]規(guī)定，破傷風(fēng)疫苗效力檢測(cè)在疫苗免疫后4周進(jìn)行毒素攻擊，計(jì)算其保護(hù)性，因此本研究選擇了免疫 4周后進(jìn)行免疫效果觀察。此外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示 TT 抗體水平在SEA的協(xié)同下顯著提高。但是，是否增高的TT 抗體水平能夠提高其保護(hù)性，還需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中建立破傷風(fēng)毒素攻擊的動(dòng)物模型進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)。

綜上所述，重組SEA和Al(OH)3佐劑聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高 TT 對(duì)小鼠的體液免疫效果，增強(qiáng)TT的免疫原性，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有一定的協(xié)同效應(yīng)，初步證明了重組SEA 作為免疫佐劑使用的可行性，為后續(xù)超抗原佐劑的研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為其應(yīng)用提供了更廣闊的前景。

[1]White J, Herman A, Pullen AM, et al.The V beta-specific superantigen staphylococcal enterotoxin B: stimulation of mature T cells and clonal deletion in neonatal mice.Cell, 1989, 56(1):27-35.

[2]Fleischer B, Schrezenmeier H.T cell stimulation by staphylococcal enterotoxins.Clonally variable response and requirement for major histocompatibility complex class II molecules on accessory or target cells.J Exp Me, 1988, 167(5):1697-1707.

[3]Mehindate K, Thibodeau J, Dohlsten M, et al.Cross-linking of major histocompatibility complex class II molecules by staphylococcal enterotoxin A superantigen is a requirement for inflammatory cytokine gene expression.J Exp Med, 1995, 182(5):1573-1577.

[4]Fraser JD.High-affinity binding of staphylococcal enterotoxins A and B to HLA-DR.Nature, 1989, 339(6221):221-223.

[5]Kotb M.Superantigens of gram-positive bacteria: structure-function analyses and their implications for biological activity.Curr Opin Microbiol, 1998, 1(1):56-65.

[6]Fischer H, Dohlsten M, Andersson U, et al.Production of TNF-alpha and TNF-beta by staphylococcal enterotoxin A activated human T cells.J Immunol, 1990, 144(12):4663-4669.

[7]Wang L, Zhang H, Zhang S, et al.Construction and characterization of a novel superantigen fusion protein: bFGF/SEB.Cancer Invest, 2009,27(4):376-383.

[8]Woody MA, Krakauer T, Stiles BG.Staphylococcal enterotoxin B mutants (N23K and F44S): biological effects and vaccine potential in a mouse model.Vaccine, 1997, 15(1):133-139.

[9]Dohlsten M, Hansson J, Ohlsson L, et al.Antibody-targeted superantigens are potent inducers of tumor-infiltrating T lymphocytes in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(21):9791-9795.

[10]Kodama H, Suzuki M, Katayose Y, et al.Mutated SEA-D227A-conjugated antibodies greatly enhance antitumor activity against MUC1-expressing bile duct carcinoma.Cancer Immunol Immunother,2001, 50(10):539-548.

[11]Wahlsten JL, Mills CD, Ramakrishnan S.Antitumor response elicited by a superantigen-transmembrane sequence fusion protein anchored onto tumor cells.J Immunology, 1998, 161(12):6761-6767.

[12]Iida H, Asada H, Yokoi S, et al.Regulatory effects of antihistamines on the responses to staphylococcal enterotoxin B of human monocyte-derived dendritic cells and CD4+ T cells.J Dermatol Sci,2008, 52(1):31-38.

[13]Jin YW, Li P, Xu QB, et al.Enhancement of immune responses to hepatitis B DNA vaccine by superantigen SEA in mice.Chin J Biotechnol, 2005, 21(5):682-685.(in Chinese)靳彥文, 李平, 胥全彬,等.超抗原SEA增強(qiáng)小鼠對(duì)HBV DNA疫苗的免疫反應(yīng).生物工程學(xué)報(bào), 2005, 21(5): 682-685.

[14]Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.Volume 3, 2010.Beijing: China Medical Science Press, 2010:58.(in Chinese)國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2010年版三部.北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:58.