hTERT m RNA在胃癌中表達及其與預(yù)后的關(guān)系

門樹成 黃寶俊

1.沈陽二四五醫(yī)院外科，沈陽 110043；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，沈陽 110001

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，就診患者中約90%為進展期胃癌，極易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，嚴重威脅著人們的身體健康。探討胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找與其相關(guān)的生物學(xué)標志物是當(dāng)今腫瘤學(xué)研究的熱點之一[1]。端粒酶是一種與細胞永生化和腫瘤形成相關(guān)的核糖核蛋白酶，它能夠以細胞內(nèi)部的一段RNA為模板合成端粒末端重復(fù)序列而延長端粒，從而使細胞永生化。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是人類端粒酶的催化亞單位，是端粒酶活性高低的限速酶。hTERT的表達與端粒酶活性呈正相關(guān)，可以反映端粒酶活性的高低[2-4]。研究已證實，端粒、hTERT與正常細胞生長調(diào)控及惡性腫瘤之間密切相關(guān)。目前有關(guān)hTERT在胃癌中的研究多集中在胃癌發(fā)生的始動階段，hTERT高表達可促進胃癌的發(fā)生[5]。然而，hTERT與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系研究相對較少。本研究選取52例胃癌患者為研究對象，應(yīng)用RT-PCR方法檢測hTERT mRNA在同一患者的正常胃黏膜、胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶（即轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)）中的表達，通過隨訪，系統(tǒng)研究hTERT mRNA在胃癌中的表達情況及其與胃癌惡性生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2001年9月～2002年9月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科52例胃癌患者為研究對象，收集患者新鮮大體組織標本。在手術(shù)切除胃癌大體標本30 min內(nèi)，切取胃原發(fā)癌灶和正常胃黏膜及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，放入消毒滅菌的EP管中，于液氮中速凍0.5 h后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中凍存等待檢測，以上標本均經(jīng)病理證實，并保留其石蠟標本。對52例患者進行隨訪，主要通過門診復(fù)查、電話信函問詢、派出所戶籍查詢等，隨訪終點為2010年9月，隨訪率為100%，隨訪時間為8～106個月，平均48.5個月。

1.2 RT-PCR檢測hTERT mRNA的表達

嚴格按照TRIzol試劑盒說明書進行操作，提取所有新鮮大體標本總RNA，測定其OD260、OD280值，對總RNA進行定量；應(yīng)用RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。取高質(zhì)量總RNA 1μg進行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，然后取3μl cDNA水溶液進行 PCR擴增，具體條件：94℃ 5 min，94℃40 s、58℃ 45 s、72℃ 60 s（30 個循環(huán)），72℃ 7 min。 hTERT 基因 引 物 序 列 為 ：5′-CGTCCAGACTCCGCTTCAT-3′，5′-TGCTTCTTGTGGTCCTCAGA-3′，產(chǎn)物為 340 bp；內(nèi)參基因GAPDH 引物序列為：5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′，5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，產(chǎn)物為 227 bp。 擴增產(chǎn)物經(jīng)梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染色檢測，詳細步驟參見文獻[6]。用Fluorchem V2.0 Stand Alone電泳凝膠掃描儀對電泳凝膠進行掃描，應(yīng)用其自帶的分析軟件進行灰度（A）測定，電泳中有擴增產(chǎn)物條帶者為陽性，無擴增產(chǎn)物條帶者為陰性；計算 hTERT mRNA表達指數(shù)（ImRNA），I=A（hTERT）/A（GAPDH），ImRNA與其在組織中的表達量呈正比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，應(yīng)用配對均數(shù)t檢驗比較hTERT mRNA在胃原發(fā)癌灶、正常胃黏膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中表達的差異；應(yīng)用單因素方差分析評估其在胃原發(fā)癌中表達與胃癌生物學(xué)行為的相關(guān)性；應(yīng)用Kaplan Meier分析繪制生存曲線，采用Log Rank檢驗評估其在胃原發(fā)癌灶中表達與預(yù)后的關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hTERT mRNA在胃原發(fā)癌灶、正常胃黏膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中表達情況的比較

與正常胃黏膜（0.022±0.093）相比，hTERT mRNA 在胃原發(fā)癌灶中（0.515±0.352）表達水平（t=9.969，P＜0.01）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中（0.729±0.578）表達水平（t=7.814，P＜0.01）明顯增高，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中增高更明顯，而其在胃原發(fā)癌灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.602，P=0.117）。在胃正常黏膜中多數(shù)表達陰性或僅有微弱條帶。內(nèi)參基因GAPDH在不同標本中表達水平基本一致（圖 1）。

圖1 hTERT mRNA在胃原發(fā)癌灶、正常胃黏膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達（RT-PCR電泳圖）

2.2 hTERT mRNA在胃原發(fā)癌灶中表達與胃癌生物學(xué)行為的相關(guān)性

經(jīng)過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，胃原發(fā)癌灶中hTERTmRNA表達水平在浸潤型癌、腫瘤浸透漿膜面、漿膜侵犯面積＞20 cm2、淋巴結(jié)分期（7thTNM 分期）晚者（N3）者中表達水平明顯增高，而在限局型癌、腫瘤未浸透漿膜面、漿膜侵犯面積≤20 cm2、淋巴結(jié)分期早者（N1～2）中表達水平相對較低。其表達水平與其他臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)性（如腫瘤大小、部位、分化程度、生長方式、有無脈管癌栓，患者性別、年齡等）（表 1）。

表1 hTERT mRNA在胃原發(fā)癌灶中表達水平與胃癌生物學(xué)行為的相關(guān)性

2.3 hTERT基因mRNA表達與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性

將hTERT mRNA在胃原發(fā)癌灶中表達水平以平均值為界分為高低兩組（其表達指數(shù)平均值為0.515），高于平均值者為高表達，低于平均值者為低表達，兩組各26例。分析兩組胃癌患者的生存情況，并繪制生存曲線（圖2）。經(jīng)Log Rank檢驗發(fā)現(xiàn)，hTERT mRNA低表達組比高表達組預(yù)后明顯好（χ2=14.20，P=0.0002）；hTERT mRNA 低表達組患者5年生存率為60.04%，高表達組患者為17.41%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在本組患者中，15例腹膜復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者中有10例為hTERT mRNA高表達，提示hTERT mRNA高表達可能與胃癌腹膜復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

圖2 hTERT mRNA表達高低兩組患者的生存曲線

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，端粒、端粒酶與腫瘤關(guān)系的研究越來越引起人們的重視。研究表明，hTERT在胃黏膜腸化生、異型增生及胃癌中表達均明顯高于正常胃黏膜，提示hTERT表達增高是胃癌發(fā)生的極早期事件，在胃癌發(fā)生的始動階段起重要作用[5，7-9]。在檢測胃癌患者外周血中hTERT mRNA表達的研究中發(fā)現(xiàn)，其表達率明顯高于胃良性病變者和健康人，表明其可以作為胃癌早診和預(yù)測微轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)指標之一，這在國內(nèi)外研究中均得到證實[10-13]。

如上所述，目前有關(guān)hTERT在胃癌中的研究多集中在胃癌發(fā)生的始動階段，有關(guān)hTERT mRNA與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后關(guān)系的報道相對較少，且意見不一。賈樹范等[9]報道hTERT的表達與腫瘤浸潤深度、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Bormann分型、遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。王維等[14]報道hTERT的表達程度與胃腺癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理類型有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)hTERT基因mRNA在胃原發(fā)癌灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中表達增高，而癌旁正常胃黏膜中表達極弱或不表達，而且在轉(zhuǎn)移灶（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌）中表達增高更為明顯。深入研究其與胃癌臨床病理因素之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)hTERT mRNA在胃原發(fā)癌灶中表達水平與胃癌浸潤深度、外科分型、漿膜侵犯面積、淋巴結(jié)分期（即轉(zhuǎn)移程度）密切相關(guān)。在腫瘤浸透胃漿膜面、浸潤型癌、漿膜侵犯面積大及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量多（7枚以上）的胃癌患者中，hTERT mRNA表達水平顯著升高。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腹腔沖洗液中端粒酶活性與胃癌分化程度、浸潤深度、漿膜受侵面積和腹膜轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。結(jié)合文獻及本研究結(jié)果表明，hTERT具有促進胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的能力，與胃癌的惡性生物學(xué)行為呈正相關(guān)。

既然hTERT mRNA與胃癌的惡性生物學(xué)行為呈正相關(guān)，可以推論其可能影響患者的預(yù)后。本研究進行生存分析時發(fā)現(xiàn)，hTERT mRNA高表達組較低表達組明顯預(yù)后不良，5年生存率分別為17.41%和60.04%，與文獻報道基本一致[16-17]。進一步分析發(fā)現(xiàn)15例腹膜復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者中有10例為hTERT mRNA高表達。本研究發(fā)現(xiàn)hTERT表達水平與TNM中N分期呈正相關(guān)，提示hTERT基因與胃癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)密切相關(guān)，有可能成為監(jiān)測胃癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)新的分子標志物和潛在的分子治療靶標，但是其詳細機制有待進一步研究探討。端粒酶啟動子甲基化可能與其高表達密切相關(guān)[18-19]。

綜上所述，胃癌組織中hTERT mRNA的表達與胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移及患者的生存期密切相關(guān)，檢測hTERT mRNA在胃癌組織中的表達情況，有助于判斷胃癌患者的轉(zhuǎn)移情況和預(yù)后，可更好地指導(dǎo)胃癌治療。

[1]Leung WK，Wu MS，Kakugawa Y，et al.Screening for gastric cancer in Asia：current evidence and practice[J].Lancet Oncol，2008，9（3）：279-287.

[2]Kyo S，Kanaya T，Takakura M，et al.Human telomerase reverse transcriptase as a critical determinant of telomerase activity in normal and malignant endometrial tissues[J].Int J Cancer，1999，80（1）：60-63.

[3]Saldanha SN，Andrews LG，Tollefsbol TO.Analysis of telomerase activity and detection of its catalytic subunit，hTERT[J].Anal Biochem，2003，315（1）：1-21.

[4]Kirkpatrick KL，Mokbel K.The significance of human telomerase reverse transcriptase （hTERT） in cancer[J].Eur J Surg Oncol，2001，27（8）：754-760.

[5]Wang Z，Xu J，Geng X，et al.Analysis of DNA methylation status of the promoter of human telomerase reverse transcriptase in gastriccar cinogenesis[J].Arch Med Res，2010，41（1）：1-6.

[6]黃寶俊，趙雨杰，徐惠綿，等.hRad17 mRNA在胃癌中表達的意義[J].中華腫瘤雜志，2003，25（2）：160-162.

[7]伍冬梅，李春鳴，張賃.胃癌組織中hTERT基因表達及意義[J].山東醫(yī)藥，2011，51（7）：65-66.

[8]王昕升，宋愛華，張健.hTERT基因在胃癌中的表達及其與幽門螺桿菌感染的關(guān)系[J].河北醫(yī)藥，2012，34（8）：1168-1169.

[9]賈樹范，陳鴻強，成雨，等.hTERT在胃良惡性病變中的表達及臨床意義[J].中國現(xiàn)代普通外科進展，2009，12（8）：657-660.

[10]胡海雷.實時熒光定量RT-PCR檢測胃癌患者外周血hTERT mRNA 表達水平[J].放射免疫學(xué)雜志，2011，24（2）：182-185.

[11]魏建敏，劉新蘭，劉奇?zhèn)悾?胃癌患者外周血hTERT mRNA的表達及意義[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2009，31（6）：502-503.

[12]Kang Y，Zhang J，Sun P，et al.Circulating cell-free human telomerase reverse transcriptase mRNA in plasma and its potential diagnostic and prognostic value for gastric cancer[J].Int J Clin Oncol，2013，18（3）：478-486.

[13]Tani N，Ichikawa D，Ikoma D，et al.Circulating cell-free mRNA in plasma as a tumor marker for patients with primary and recurrent gastric cancer[J].Anticancer Res，2007，27（2）：1207-1012.

[14]王維，梁旭陽，伍潔，等.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2009，18（6）：521-523.

[15]Hu X，Wu H，Zhang S，et al.Clinical significance of telomerase activity in gastric carcinoma and peritoneal dissemination[J].J Int Med Res，2009，37（4）：1127-1138.

[16]邱冬，王文玲，周建獎.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA在胃癌組織中的定量表達及其與胃癌預(yù)后的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志，2011，33（1）：32-36.

[17]Sasaki T，Kuniyasu H，Luo Y，et al.AKT activation and telomerase reverse transcriptase expression are concurrently associated with prognosis of gastric cancer[J].Pathobiology，2013，81（1）：36-41.

[18]Gigek CO，Leal MF，Silva PN，et al.hTERT methylation and expression in gastric cancer[J].Biomarkers，2000，14（8）：630-636.

[19]Wang Z，Xu J，Geng X，et al.Analysis of DNA methylation status of the promoter of human telomerase reverse transcriptase in gastriccarcinogenesis[J].Arch Med Res，2010，41（1）：1-6.